豆莢特異性啟動子GmPLC12的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一個豆莢特異性啟動子及其在培育轉(zhuǎn)基因植 物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 啟動子是基因的一個組成部分，控制基因表達的起始時間和表達程度。啟動子本 身并不控制基因的功能，轉(zhuǎn)錄因子可以與基因的啟動子結(jié)合而調(diào)控基因的表達。高等植物 基因啟動子主要可以分為三種類型：組成型啟動子、組織特異性啟動子與誘導型啟動子。組 成型啟動子是應(yīng)用最早、最廣泛的一類啟動子。其中應(yīng)用最廣泛的啟動子為廣大 植物學工作者所認可。該啟動子從花椰菜花葉病毒中克隆得到的，在植物的大部分組織中 都具有高效的表達，啟動子是基因功能鑒定的首選啟動子。誘導型啟動子在正常 生長條件下表達量非常低，在特定誘導條件下才可以驅(qū)動目的基因的表達。而組織特異性 啟動子是一種只在特定組織中表達的啟動子，如：根特異性表達啟動子，種子特異性啟動子 等。
[0003] 隨著組成型啟動子(如啟動子）的廣泛應(yīng)用，人們發(fā)現(xiàn)組成型啟動子并不 適合通過基因工程手段改良作物性狀。因為組成型啟動子不僅可以驅(qū)動目的基因的超表 達，而且這種超表達沒有時間與空間的限制，即：在任何時間、任何地點目的基因的表達量 均很高。這將造成植物自身能量消耗變大，所以組成型超表達的轉(zhuǎn)基因植株多表現(xiàn)出植株 矮小等形狀。為了避免這個問題，組織特異性啟動子與誘導型啟動子的開發(fā)利用成為基因 工程研宄的一個熱點。
[0004] 植物組織特異性啟動子是指能夠驅(qū)動目的基因在植物的特定組織中表達的一種 啟動子，通過組織特異性啟動子的應(yīng)用將使目的基因可以按照人們的設(shè)計在某一組織中表 達。目前植物組織特異性啟動子應(yīng)用較多的為根特異性啟動子以及種子特異性啟動子。根 特異性啟動子可以驅(qū)動一些與根部生長發(fā)育與水分及礦物質(zhì)運輸相關(guān)的基因在植物根部 特異表達。而種子特異性啟動子可以驅(qū)動一些與油脂合成以及一些調(diào)控作物產(chǎn)量相關(guān)的基 因在種子中表達。豆莢是大豆成熟過程中包裹種子的一種植物器官，人們對豆莢特異性啟 動子的研宄相對較少。豆莢特異性啟動子可以增加外源基因在豆莢形成期莢中的表達量， 能夠有效減少對植物其他組織器官的不利影響，為基因工程育種的精確性和安全性提供了 新的原件。本專利公開了一種大豆豆莢特異性啟動子GmPLC12,該啟動子在早期豆莢中的表 達量非常高，而在其它組織中的表達量較低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是為解決組成型起動子超表達造成植物自身能量消耗大，轉(zhuǎn)基因植 株多表現(xiàn)出植株矮小的問題，而提供一個豆莢特異性啟動子GmPLC12。
[0006] 豆莢特異性啟動子GmPLC12,其核苷酸序列如序列表SEQIDNo. 1所示。
[0007] 夾特異性啟動子GmPLC12的制備方法，它是以大品種威廉姆斯82基因組DNA 為模板用引物 F :GCCTGCTAAAAATATAITTG 與 R :TCATGGAGACCTCAATATAA 擴增，獲得。
[0008] -種表達載體，它是在表達載體中插入了如序列表SEQ IDNo.1所不的啟動子。
[0009] 本發(fā)明的又一個目的是提供的豆莢特異性啟動子GmPLC12在培育轉(zhuǎn)基因植物的 應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明提供了豆莢特異性啟動子GmPLC12來源于大豆品種威廉姆斯82,其核苷酸 序列見SEQ ID No. 1。它是以威廉姆斯82基因組DNA為模板，通過PCR方法獲得中間片段 后，在大豆基因組中map到該基因啟動子區(qū)域，從而獲得基因啟動子的全長核苷酸 序列?；騿幼釉谠缙诙骨v中特異表達，而在其他部位表達較低。證明 基因啟動子具有豆莢表達的特異性；為豆莢專一性遺傳信息改造提供優(yōu)質(zhì)的啟動元件。
【附圖說明】
[0011] 圖1為大豆豆莢特異性啟動子GmPLC12的PCR檢測，M :DNA Marker DL2000 ;1:啟 動子PCR產(chǎn)物； 圖2為基因組織表達量分析結(jié)果； 圖3為基因啟動子與⑶S融合表達載體圖； 圖4為GUS活性測定結(jié)果。
【具體實施方式】
[0012] 實施例1提取大基因組DNA 將大豆"威廉姆斯82"(購買于種子公司)種子播在液體營養(yǎng)缽中，放在培養(yǎng)室中進行培 養(yǎng)。取生長大豆幼苗嫩葉，按照植物基因組DNA小量提取試劑盒進行提取大豆基因組DNA。 提取步驟如下： (1)在65°C水浴中預熱buffer S1，同時預熱洗脫緩沖液（EB)。
[0013] (2)取適量鮮嫩的大豆葉片，在液氮中充分碾磨。
[0014] (3)轉(zhuǎn)移研磨成功的細粉(約100 mg)到一個新的的1. 5 ml EP管中，加入550 ML 65°C預熱buffer S1和7 ML RNA酶，渦旋震蕩至完全混合，室溫條件下靜止放置10分鐘。
[0015] (4)在離心管中加入130 ML的buffer S2,需要渦旋震蕩至完全混合，放入離心機 內(nèi)12000 rpm離心5分鐘。
[0016] (5)吸取上清置于藍色分離柱A中，12000 rpm離心1分鐘，收集下液。
[0017] (6)加入1. 5倍體積buffer S3后立即緩慢的上下顛倒數(shù)次至充分混合。
[0018] (7)將已得混合物(包括可能出現(xiàn)的白色絮狀沉淀)加入至白色吸附柱AC中，12000 rpm離心1分鐘，棄廢液。
[0019] (8)加入700 ML漂洗液WB，12000 rpm離心1分鐘，棄廢液。
[0020] (9)重復步驟（8)-次。
[0021] (10)將吸附柱AC放回收集管中，12000 rpm離心30秒。
[0022] (11)將吸附柱AC置于無核酸酶的EP管中，用事先預熱的洗脫緩沖液EB洗脫，室 溫放置1-2分鐘，12000 rpm離心30秒，收集大豆基因組DNA。
[0023] 實施例2大豆基因啟動子的克隆 以大豆基因組DNA為模板，利用引物PLC12-F (GCCTGCTAAAAATATAITTG)與PLC12-R (TCATGGAGACCTCAATATAA)對基因啟動子進行克隆，PCR體系見表1，PCR程序為 94 °C預變性10分鐘，94 °C變性1分鐘，60 °C退火1分鐘，延伸2分鐘，共進行35個循環(huán)。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測（結(jié)果見圖1)后，連接克隆載體PEASY-T1 (購自全式金生物技 術(shù)有限公司）生成pEASY-GmPLC12后進行測序，測序結(jié)果見SEQ ID No.1。
【主權(quán)項】
1. 豆莢特異性啟動子GmPLC12,其核苷酸序列如序列表SEQ ID No. 1所示。
2. 豆莢特異性啟動子GmPLC12的制備方法，它是以大豆品種威廉姆斯82基因組DNA為 模板，用引物 F :GCCTGCTAAAAATATAITTG 與 R :TCATGGAGACCTCAATATAA 擴增，獲得。
3. -種表達載體，它是在表達載體中插入了如序列表SEQ ID No. 1所示的啟動子。
4. 豆莢特異性啟動子GmPLC12在培育轉(zhuǎn)基因植物的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了大豆豆莢特異性啟動子GmPLC12來源于威廉姆斯82，其核苷酸序列見SEQ ID No.1。它是以威廉姆斯82基因組DNA為模板，通過PCR方法獲得中間片段后，在大豆基因組中map到該基因啟動子區(qū)域，從而獲得GmPLC12基因啟動子的全長核苷酸序列。GmPLC12基因啟動子在早期豆莢中特異表達，而在其他部位表達較低。證明GmPLC12基因啟動子具有豆莢表達的特異性；為豆莢專一性遺傳信息改造提供優(yōu)質(zhì)的啟動元件。
【IPC分類】C12N15-82, C12N15-10, C12N15-113, A01H5-00
【公開號】CN104789567
【申請?zhí)枴緾N201510206458
【發(fā)明人】王法微, 李海燕, 鄧宇, 王南, 李曉薇, 董園園, 陳歡, 董金曄
【申請人】吉林農(nóng)業(yè)大學
【公開日】2015年7月22日
【申請日】2015年4月28日