一種家蠶質型多角體病毒的體外構建方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于病毒基因工程領域，具體涉及一種家蠶質型多角體病毒的體外構建方 法。
【背景技術】
[0002] 呼腸孤病毒科（Reoviridae)病毒是一類能感染動物、植物以及真菌的雙鏈RNA (dsRNA)病毒。質型多角體病毒（Cytoplasmic polyhedrosis virus，簡稱CPVs)是呼腸孤 病毒科質型多角體病毒屬（Cypovirus)中的成員，其基因組由9至11個雙鏈RNA片段組成。 CPVs是農林害蟲的重要病原，能感染鱗翅目（Ze/?i￡/o/7te_ra)、膜翅目（辦膨和鞘翅 目（Cbhoptera)昆蟲，在害蟲自然種群控制方面發(fā)揮重要的作用，是一種極具開發(fā)潛力的 生物殺蟲劑。
[0003] 根據(jù)CPVs基因組dsRNA在聚丙烯酰胺凝膠電泳中的迀移模式，CPVs可分為20 種不同的類型。家香質型多角體病毒（及咖cytoplasmic polyhedrosis virus， BmCPV)是CPV1型中的典型種，能感染家蠶中腸細胞，導致家蠶發(fā)生質型多角體病，進而引 起養(yǎng)蠶歉收。家蠶質型多角體病毒基因組由S1至S10共計10個雙鏈RNA片段組成，各個 片段的序列業(yè)已明確。
[0004] 通常，獲取家蠶質型多角體病毒的方法是從自然發(fā)生的或人工感染的患質型多角 體病的家蠶中腸中提純，但這種方法必須利用家蠶這一宿主。另外，家蠶質型多角體病毒的 基因組為分節(jié)段的雙鏈RNA病毒，利用常規(guī)的遺傳操作技術難以對家蠶質型多角體病毒基 因組進行改造，進而獲得重組病毒，從而導致CPVs基因組各片段的功能研宄進展緩慢，也 無法獲得重組CPVs殺蟲劑。
[0005] 到目前為止，未見體外構建家蠶質型多角體病毒的報道。因此，開發(fā)家蠶質型多角 體病毒基因組雙鏈RNA片段的遺傳操作技術，建立家蠶質型多角體病毒的體外構建方法， 不但對于家蠶質型多角體病毒基因組各片段的功能研宄具有促進作用，而且也可以為重組 CPVs生物殺蟲劑的研發(fā)提供理論指導和技術支撐。

【發(fā)明內容】

[0006] 針對上述情況，本發(fā)明的目的在于提供一種家蠶質型多角體病毒的體外構建方法 以及所使用的引物。
[0007] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術方案如下所述： 一種家蠶質型多角體病毒的體外構建方法，其包括下列步驟： (1) 獲得家蠶質型多角體病毒基因組； (2) 根據(jù)家蠶質型多角體病毒基因組Sl、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10片段的雙 鏈 RNA 的末端序列，設計并合成 10 對引物：PS1F/PS1R、PS2F/PS2R、PS3F/PS3R、PS4F/PS4R、 PS5F/PS5R、PS6F/PS6R、PS7F/PS7R、PS8F/PS8R、PS9F/PS9R、PS10F/PS10R，其中所述引物的 編號情況如下： 引物 PS1F 對應 SEQ ID N0:1，引物 PS1R 對應 SEQ ID N0:2， 引物卩52卩對應5￡〇10勵:3，引物卩521?對應5￡〇10勵:4， 引物 PS3F 對應 SEQ ID NO: 5,引物 PS3R 對應 SEQ ID NO:6， 引物 PS4F 對應 SEQ ID NO: 7,引物 PS4R 對應 SEQ ID NO:8， 引物 PS5F 對應 SEQ ID NO:9,引物 PS5R 對應 SEQ ID NO: 10， 引物 PS6F 對應 SEQ ID NO: 11，引物 PS6R 對應 SEQ ID NO: 12， 引物 PS7F 對應 SEQ ID NO: 13,引物 PS7R 對應 SEQ ID NO: 14， 引物 PS8F 對應 SEQ ID NO: 15,引物 PS8R 對應 SEQ ID NO: 16， 引物 PS9F 對應 SEQ ID NO: 17,引物 PS9R 對應 SEQ ID NO: 18， 引物？51(^對應5￡〇10勵：19，引物卩5101?對應5￡〇10勵：20， 各個引物的序列如下所示：
【主權項】
1. 一種家蠶質型多角體病毒的體外構建方法，其包括下列步驟： 1) 獲得家蠶質型多角體病毒基因組； 2) 根據(jù)家蠶質型多角體病毒基因組Sl、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、SlO片段的雙 鏈RNA的末端序列，設計并合成 10 對引物：PS1F/PS1R、PS2F/PS2R、PS3F/PS3R、PS4F/PS4R、 PS5F/PS5R、PS6F/PS6R、PS7F/PS7R、PS8F/PS8R、PS9F/PS9R、PS10F/PS10R，其中所述引物的 編號情況如下： 引物 PSlF 對應SEQIDNO: 1，引物 PSlR對應SEQIDNO:2， 引物 PS2F 對應SEQIDNO: 3,引物 PS2R對應SEQIDNO:4， 引物 PS3F 對應SEQIDNO: 5,引物 PS3R對應SEQIDNO:6， 引物 PS4F 對應SEQIDNO: 7,引物 PS4R對應SEQIDNO:8， 引物PS5F對應SEQIDNO:9,引物PS5R對應SEQIDNO: 10， 引物PS6F 對應SEQIDNO: 11，引物PS6R對應SEQIDNO: 12， 引物PS7F 對應SEQIDNO: 13,引物PS7R對應SEQIDNO: 14， 引物PS8F 對應SEQIDNO: 15,引物PS8R對應SEQIDNO: 16， 引物PS9F 對應SEQIDNO: 17,引物PS9R對應SEQIDNO: 18， 引物PSlOF對應SEQIDNO: 19,引物PSlOR對應SEQIDN0:20， 所述引物的核苷酸序列如SEQIDNO: 1至SEQIDNO:20所示； 3) 獲得Sl至SlO片段的cDNA; 4) 分別以步驟3)中獲得的Sl至SlO片段的cDNA為模板，對應使用步驟2)中合成的 10對引物進行PCR擴增，獲得Sl至SlO片段全長cDNA的擴增產物； 5) 將步驟4)中獲得的Sl至SlO片段全長cDNA的擴增產物分別使用限制性內切酶進 行酶切，然后克隆到質粒載體中，獲得分別帶有Sl至SlO片段全長cDNA的重組質粒pT-Sl、 pT-S2、pT-S3、pT-S4、pT-S5、pT-S6、pT-S7、pT-S8、pT-S9、pT-S10,其中所述限制性內切酶 的使用情況如下： Sl片段全長cDNA的擴增產物用5^1和fecll進行酶切； S2片段全長cDNA的擴增產物用5^1和fecll進行酶切； S3片段全長cDNA的擴增產物用5^1和fecll進行酶切； S4片段全長cDNA的擴增產物用如M和fecll進行酶切； S5片段全長cDNA的擴增產物用辦7/?1和fecll進行酶切； S6片段全長cDNA的擴增產物用辦7/?1和fecll進行酶切； S7片段全長cDNA的擴增產物用辦ml和ZhI進行酶切； S8片段全長cDNA的擴增產物用辦7/?1和fecll進行酶切； S9片段全長cDNA的擴增產物用辦7/?1和fecll進行酶切； SlO片段全長cDNA的擴增產物用辦7/?1和fecll進行酶切； 6) 將步驟5)中獲得的pT-Sl至pT-SlO重組質粒分別使用限制性內切酶進行酶切、線 性化后，作為模板備用，經(jīng)過體外轉錄，獲得Sl至SlO片段的RNA，其中所述限制性內切酶的 使用情況如下： 重組質粒PT-Sl用fecll進行酶切； 重組質粒PT-S2用fecll進行酶切； 重組質粒PT-S3用fecll進行酶切； 重組質粒PT-S4用fecll進行酶切； 重組質粒PT-S5用fecll進行酶切； 重組質粒PT-S6用fecll進行酶切； 重組質粒PT-S7用油al進行酶切； 重組質粒PT-S8用fecll進行酶切； 重組質粒PT-S9用fecll進行酶切； 重組質粒PT-SlO用fecll進行酶切； 7)將步驟6)中獲得的Sl至SlO片段的RNA等摩爾混合，使用脂質體進行包裹并轉染 宿主，待觀察到宿主的細胞質內形成大量多角體時，收集細胞并破碎，離心純化，獲得體外 構建的家蠶質型多角體病毒。
2. 根據(jù)權利要求1所述的家蠶質型多角體病毒的體外構建方法，其特征在于，步驟1) 中所述家蠶質型多角體病毒基因組的獲得采用實驗室提取或者商業(yè)購買的方法來實現(xiàn)。
3. 根據(jù)權利要求2所述的家蠶質型多角體病毒的體外構建方法，其特征在于，在實驗 室提取的情況下，從家蠶質型多角體病毒粒子或家蠶質型多角體中提取病毒基因組，優(yōu)選 從家蠶質型多角體中提取病毒基因組。
4. 根據(jù)權利要求1所述的家蠶質型多角體病毒的體外構建方法，其特征在于，步驟3) 中所述Sl至SlO片段的cDNA的獲得采用基于RNA序列的全人工合成或反轉錄的方法來實 現(xiàn)。
5. 根據(jù)權利要求4所述的家蠶質型多角體病毒的體外構建方法，其特征在于，在反轉 錄的情況下，將步驟1)中獲得的家蠶質型多角體病毒基因組于l〇〇°C煮沸10分鐘，再冰浴2 分鐘后，作為模板備用，分別使用步驟2)中合成的引物PS1R、PS2R、PS3R、PS4R、PS5R、PS6R、 PS7R、PS8R、PS9R、PSlOR進行反轉錄，對應獲得SI至SlO片段的cDNA。
6. 根據(jù)權利要求1所述的家蠶質型多角體病毒的體外構建方法，其特征在于，步驟5) 中所述質粒載體選自pIZT-V5/His載體、pUC系列載體、pBlueScriptSKII載體中的任意 一種，優(yōu)選pIZT-V5/His載體。
7. 根據(jù)權利要求1所述的家蠶質型多角體病毒的體外構建方法，其特征在于，步驟6) 中用于體外轉錄的模板是步驟5)中獲得的重組質粒pT-Sl至pT-SlO或者是以步驟5)中 獲得的重組質粒PT-Sl至pT-SlO為模板，對應使用步驟2)中合成的10對引物進行PCR擴 增后獲得的擴增產物。
8. 根據(jù)權利要求1所述的家蠶質型多角體病毒的體外構建方法，其特征在于，步驟7) 中所述脂質體為Lipofectamine2000。
9. 根據(jù)權利要求1所述的家蠶質型多角體病毒的體外構建方法，其特征在于，步驟7) 中所述宿主是家蠶或家蠶培養(yǎng)細胞，優(yōu)選家蠶培養(yǎng)細胞，更優(yōu)選家蠶BmN培養(yǎng)細胞。
10. 用于上述權利要求中任一項所述的家蠶質型多角體病毒的體外構建方法的10對 引物，所述引物的核苷酸序列如SEQIDNO: 1至SEQIDNO:20所示。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種家蠶質型多角體病毒的體外構建方法。具體而言，本發(fā)明的方法包括下列步驟：1）獲得家蠶質型多角體病毒基因組；2）設計并合成引物；3）獲得病毒基因組S1至S10片段的cDNA；4）對cDNA進行PCR擴增；5）將擴增產物進行酶切，然后克隆到質粒載體中，獲得重組質粒；6）將重組質粒進行酶切、線性化后，經(jīng)過體外轉錄，獲得RNA；以及7）將RNA等摩爾混合，使用脂質體進行包裹并轉染宿主，進而獲得體外構建的家蠶質型多角體病毒。本發(fā)明的家蠶質型多角體病毒的體外構建方法不但對家蠶質型多角體病毒基因組各片段的功能研究有促進作用，也可以為重組質型多角體病毒生物殺蟲劑的研發(fā)提供技術支持。
【IPC分類】C12N15-11, C12N15-88, C12R1-93, C12N15-46, C12N7-00
【公開號】CN104789597
【申請?zhí)枴緾N201510209183
【發(fā)明人】貢成良, 薛仁宇, 曹廣力, 胡小龍, 郭睿
【申請人】蘇州大學
【公開日】2015年7月22日
【申請日】2015年4月28日