一種青蛤酶解多肽的制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及海洋生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種青蛤酶解多肽的制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 青蛤（Cyclina sinensis)屬軟體動物門、瓣鰓綱、簾蛤目、簾蛤科，俗稱黑蛤、圓 蛤、鐵蛤等，分布于我國沿海潮間帶的泥砂灘中，是我國沿海地區(qū)常見的一種貝類。青蛤肉 質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富，除有較高的食用價值之外還是一種重要的海洋藥物，《神農(nóng)本草經(jīng)》、《本 草綱目》以及《本草綱目拾遺》均將青蛤作為一種常用藥物收錄在其中。
[0003] 近年來對海產(chǎn)品的酶解多肽研宄較多，如：專利號為ZL201010253745. 0(授權(quán)公 告號為CN 102372765 B)的中國發(fā)明專利《菲律賓蛤仔酶解多肽的制備方法》公開了一種菲 律賓蛤仔酶解多肽（Asp Trp Pro His)的制備方法，同時還公開了該酶解多肽的應(yīng)用。目 前研宄表明，青蛤肉提取物能增加老年大鼠脾中的淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞活性及淋巴結(jié)中的 巨噬細(xì)胞活性，對提高細(xì)胞免疫應(yīng)答及機(jī)體正常免疫力等有重要的作用；粗青蛤多糖在體 外具有抗氧化活性，對四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝毒性模型具有重要的保護(hù)作用，但關(guān)于青蛤 酶解多肽的研宄目前未見報道，尤其是青蛤酶解多肽在抗氧化活性方面的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的第一個技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)而提供一種青蛤酶解多肽的 制備方法。
[0005] 本發(fā)明所要解決的第二個技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)而提供上述青蛤酶解多肽在 抗氧化活性方面的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明解決第一個技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：一種青蛤酶解多肽的制備方 法，
[0007] 其特征在于包括以下步驟：
[0008] (1)取新鮮的青蛤，去殼取內(nèi)臟，用勻漿機(jī)破碎，得青蛤內(nèi)臟勻漿液；
[0009] (2)在上述勻漿液中按1:3~4的比例加入蒸餾水，用一定濃度的鹽酸和氫氧化鈉 溶液調(diào)節(jié)勻漿液的pH值至9~11，加入1000~2000u/g堿性蛋白酶，40~50°C酶解4~ 8h，沸水滅活10~15min ;
[0010] (3)將滅活后的酶解液冷卻至室溫，9000~10000r/min離心10~15min，取上清 液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，冷凍干燥得青蛤酶解多肽。
[0011] 作為優(yōu)選，所述步驟（2)中酶解溫度為50°C，酶解時間為4h，堿性蛋白酶添加量為 2000u/g，酶解 pH 為 9。
[0012] 作為優(yōu)選，所述青蛤酶解多肽的分子量為15~25KDa。
[0013] 本發(fā)明解決第二個技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：上述青蛤酶解多肽在抗氧化活 性產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0014] 進(jìn)一步，所述抗氧化活性為對自由基的清除作用、對Fe2+離子的螯合作用、還原能 力以及對PBR322DNA損傷的保護(hù)作用。
[0015] 再進(jìn)一步，所述的自由基為羥基自由基和DPPH自由基，所述pBR322DNA損傷由羥 基自由基誘導(dǎo)。
[0016] 再進(jìn)一步，所述青蛤酶解多肽濃度為1. 57mg/mL時，對DPPH自由基的清除率達(dá)到 50%，所述青蛤酶解多肽濃度為5mg/mL時，對DPPH自由基的清除率達(dá)到91. 24% ;所述青 蛤酶解多肽濃度為2. lmg/mL時，對DPPH自由基的清除率達(dá)到50%，所述青蛤酶解多肽濃度 為5mg/mL時，對DPPH自由基的清除率達(dá)到62. 83% ;青蛤酶解多肽對Fe2+離子的螯合能力 的EC50為2. 75mg/mL，且青蛤酶解多肽濃度為5mg/mL時，螯合力為61. 13%;所述青蛤酶解 多肽的還原能力與其濃度呈正相關(guān)，且還原力為0.331。
[0017] 上述方案中的抗氧化活性產(chǎn)品可為食品、藥品、保健品以及化妝品。
[0018] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：青蛤是一種常見的海產(chǎn)貝類，以新鮮青蛤為 原料酶解提取青蛤酶解多肽，原材料來源廣，成本低，操作方便，并且提取的青蛤酶解多肽 具有較好的抗氧化活性，其中對DPPH自由基的清除率可高達(dá)91. 24%，對羥自由基的清除 率可達(dá)62. 83 %，對Fe2+的螯合力為61. 13 %，還原力為0? 331，并且對由羥自由基誘導(dǎo)損傷 的PBR322DNA有一定的保護(hù)作用，可廣泛應(yīng)用于抗氧化活性產(chǎn)品中。
【附圖說明】
[0019] 圖1為實施例2中青蛤酶解多肽對DPPH自由基的清除率示意圖；
[0020] 圖2為實施例3中青蛤酶解多肽對羥自由基的清除率示意圖；
[0021] 圖3為實施例4中青蛤酶解多肽對Fe2+離子的螯合作用示意圖；
[0022] 圖4為實施例5中青蛤酶解多肽的還原力示意圖；
[0023] 圖5為實施例6中青蛤酶解多肽抗羥自由基誘導(dǎo)pBR322DNA損傷能力的瓊脂糖凝 膠電泳圖；
[0024] 圖6為實施例7中青蛤酶解多肽的SDS-PAGE電泳圖。
【具體實施方式】
[0025] 以下結(jié)合附圖實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0026] 下述各實施例中使用的原料和試劑如下：
[0027] 新鮮青蛤購于舟山南珍市場，去殼取內(nèi)臟，-20°C冷凍保存?zhèn)溆茫粔A性蛋白酶購于 北京亞太恒信生物科技有限公司；鄰二氮菲、DPPH、鐵氰化鉀購自上海晶純試劑有限公司； 其余試劑為分析純均購置國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
[0028] 儀器如下：
[0029] BSA1245型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；CF16RX高速冷凍離心機(jī)（日 立公司）；UV-1600PC型紫外分光光度計（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；SSW型微電腦電熱恒 溫水槽（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；DYCZ-28C型電泳儀（北京六一儀器廠）。
[0030] 實施例1 :酶解制備青蛤酶解多肽
[0031] 取上述青蛤內(nèi)臟作為原料，將原料用勻漿機(jī)破碎，得青蛤內(nèi)臟勻漿液。在上述勻 漿液中按1:3~4的比例加入蒸餾水，用一定濃度的鹽酸和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)勻漿液的pH 值，加入堿性蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解結(jié)束后沸水滅活10~15min。將滅活后的酶解液冷卻至 室溫，9000~10000r/min離心10~15min，取上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，冷凍干燥得青蛤酶解 多肽。
[0032] 如表1所示，考慮酶解過程中的四個因素：1溫度、2時間、3加酶量、4pH，對酶解 效果的影響，每個因素選取三個水平進(jìn)行正交實驗，比較堿性蛋白酶在不同水解條件下的 DPPH自由基清除率（具體過程參見實施例2)，從而確定堿性蛋白酶的最佳水解條件。
[0033] 表1堿性蛋白酶因素與水平
【主權(quán)項】
1. 一種青蛤酶解多肽的制備方法，其特征在于包括以下步驟： (1) 取新鮮的青蛤，去殼取內(nèi)臟，用勻漿機(jī)破碎，得青蛤內(nèi)臟勻漿液； (2) 在上述勻漿液中按1:3~4的比例加入蒸餾水，用一定濃度的鹽酸和氫氧化鈉溶液 調(diào)節(jié)勻漿液的pH值至9~11，加入1000~2000u/g堿性蛋白酶，40~50°C酶解4~8h， 沸水滅活10~15min; (3) 將滅活后的酶解液冷卻至室溫，9000~lOOOOr/min離心10~15min，取上清液旋 轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，冷凍干燥得青蛤酶解多肽。
2. 如權(quán)利要求1所述的青蛤酶解多肽的制備方法，其特征在于，其特征在于，所述步驟 (2)中酶解溫度為50°C，酶解時間為4h，堿性蛋白酶添加量為2000u/g，酶解pH為9。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的青蛤酶解多肽的制備方法，其特征在于，所述青蛤酶解多肽 的分子量為15~25KDa。
4. 一種如權(quán)利要求1所述的青蛤酶解多肽在抗氧化活性產(chǎn)品中的應(yīng)用。
5. 如權(quán)利要求4所述的青蛤酶解多肽在抗氧化活性產(chǎn)品中的應(yīng)用，其特征在于，所述 抗氧化活性為對自由基的清除作用、對Fe2+離子的螯合作用、還原能力以及對pBR322DNA損 傷的保護(hù)作用。
6. 如權(quán)利要求5所述的青蛤酶解多肽在抗氧化活性產(chǎn)品中的應(yīng)用，其特征在于，所述 的自由基為羥基自由基和DPPH自由基，所述pBR322DNA損傷由羥基自由基誘導(dǎo)。
7. 如權(quán)利要求6所述的青蛤酶解多肽在抗氧化活性產(chǎn)品中的應(yīng)用，其特征在于，所述 青蛤酶解多肽濃度為I. 57mg/mL時，對DPPH自由基的清除率達(dá)到50%，所述青蛤酶解多肽 濃度為5mg/mL時，對DPPH自由基的清除率達(dá)到91. 24% ; 所述青蛤酶解多肽濃度為2.lmg/mL時，對DPPH自由基的清除率達(dá)到50 %，所述青蛤酶 解多肽濃度為5mg/mL時，對DPPH自由基的清除率達(dá)到62. 83% ;青蛤酶解多肽對Fe2+離子 的螯合能力的EC50為2. 75mg/mL，且當(dāng)青蛤酶解多肽濃度為5mg/mL時，螯合力為61. 13%; 所述青蛤酶解多肽的還原能力與其濃度呈正相關(guān)，且還原力為〇? 331。
8. 如權(quán)利要求4~7中任一權(quán)利要求所述的青蛤酶解多肽在抗氧化活性產(chǎn)品中的應(yīng) 用，其特征在于，所述抗氧化活性產(chǎn)品為食品、藥品、保健品以及化妝品。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種青蛤酶解多肽的制備方法，由新鮮青蛤，取內(nèi)臟，勻漿后的勻漿液，在勻漿液加入堿性蛋白酶進(jìn)行酶解，將酶解液離心取上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，冷凍干燥得青蛤酶解多肽，該青蛤酶解多肽的分子量為15～25KDa。該青蛤酶解多肽具有較好的抗氧化活性，其中對DPPH自由基的清除率可高達(dá)91.24％，對羥自由基的清除率可達(dá)62.83％，對Fe2+的螯合力為61.13％，其還原力為0.331，并且對由羥自由基誘導(dǎo)損傷的pBR322 DNA有一定的保護(hù)作用，可廣泛應(yīng)用于抗氧化活性產(chǎn)品中。
【IPC分類】C12P21-06
【公開號】CN104789626
【申請?zhí)枴緾N201510099953
【發(fā)明人】楊最素, 丁國芳, 潘欣, 趙莎莎, 趙玉勤, 閆海強(qiáng)
【申請人】浙江海洋學(xué)院
【公開日】2015年7月22日
【申請日】2015年3月6日