轉(zhuǎn)基因大豆品系呼交06-698的檢測(cè)方法及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種轉(zhuǎn)基因大豆品系呼交06-698的檢 測(cè)方法及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 2010年全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積達(dá)1. 48億hm2,其中以抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆商品 化種植面積最大。據(jù)報(bào)道，美國(guó)、阿根廷和巴西抗草甘膦大豆播種面積分別占其大豆總種植 面積的91%、99%和71%。草甘膦是一種非選擇性內(nèi)吸型有機(jī)磷類廣譜除草劑，它的作用是特 異性地抑制植物和細(xì)菌中莽草酸羥基乙烯轉(zhuǎn)移酶（EPSPS)的活性。種植抗草甘膦大豆使滅 生性藥劑草甘膦在大豆田苗后噴施成為可能。其在擴(kuò)大殺草譜、減輕除草劑土壤殘留危害、 降低種植成本等方面起到了較大作用。轉(zhuǎn)基因作物在給人們帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益 的同時(shí)，其安全性也讓各國(guó)民眾產(chǎn)生擔(dān)憂，引起廣泛爭(zhēng)論和全社會(huì)高度關(guān)注。世界各國(guó)紛紛 采取措施加強(qiáng)對(duì)轉(zhuǎn)基因生物研發(fā)、生產(chǎn)、加工和進(jìn)出口等過(guò)程中的安全監(jiān)管，以保障生態(tài)安 全和人類健康。我國(guó)針對(duì)轉(zhuǎn)基因生物的安全性問(wèn)題也制定了一系列法律法規(guī)和管理辦法， 對(duì)其實(shí)行安全評(píng)價(jià)、生產(chǎn)許可、產(chǎn)品標(biāo)識(shí)、進(jìn)口許可和快速而精準(zhǔn)的檢測(cè)是這一制度順利實(shí) 施的前提和保障。我國(guó)2001年頒布實(shí)施《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例》，其中第四章第 二十八條明確規(guī)定，在中華人民共和國(guó)境內(nèi)銷售列入農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識(shí)目錄的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基 因生物，應(yīng)當(dāng)有明顯的標(biāo)識(shí)。因此，為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品實(shí)施標(biāo)簽制度的定量檢測(cè)技術(shù)顯得尤為重 要。
[0003] 由于國(guó)外轉(zhuǎn)基因大豆品種不能在國(guó)內(nèi)直接種植，利用通過(guò)材料轉(zhuǎn)移協(xié)議獲得的抗 除草劑轉(zhuǎn)基因大豆種質(zhì)AG5601為父本、以中作92121 (中黃11)為母本進(jìn)行雜交，培育出攜 帶有抗性基因CP4EPSPS的抗草甘膦除草劑大豆新品系N03-1。利用N03-1為父本與蒙豆 13雜交，選育出呼交02-92,再與蒙豆12雜交和2次回交。后代經(jīng)過(guò)噴灑草甘膦除草劑鑒 定抗性和分子生物學(xué)檢測(cè)，選育出攜帶有CP4EPSPS基因、抗草甘膦且綜合性狀好的轉(zhuǎn)基因 大ii新品系呼父06-698。
[0004] 本發(fā)明根據(jù)轉(zhuǎn)基因大豆新品系呼交06-698側(cè)翼序列設(shè)計(jì)引物探針，用于檢測(cè)轉(zhuǎn) 基因大豆呼交06-698。利用該方法，在實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)束后即能判斷所檢測(cè)大豆樣品是否 為轉(zhuǎn)基因大豆品系呼交06-698。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為完善轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品實(shí)施標(biāo)簽制度的定量檢測(cè)技術(shù)，本發(fā)明的目的是提供一種轉(zhuǎn)基 因大豆品系呼交06-698的檢測(cè)方法及試劑盒。
[0006] 本發(fā)明所用TaqMan熒光探針是一種寡核苷酸探針，熒光基團(tuán)連接在探針的5'末 端，而淬滅劑則在3'末端。PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針， 探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5'-3'外切酶 活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到 熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn) 物形成完全同步。通過(guò)這種方法，就能夠檢測(cè)到樣品中是否有轉(zhuǎn)基因大豆品系呼交06-698。
[0007] 本發(fā)明提供用于轉(zhuǎn)基因大豆品系呼交06-698的檢測(cè)方法的一對(duì)特異性引物，其 為：
[0008]正向引物：5' -TTCATTCAAAATAAGATCATACATACAGGTT-3'（如 SEQ IDNO. 1 所示）；
[0009]反向引物：5'-GGCAITTGTAGGAGCCACCTT-3'（如 SEQ IDNO.2所示）。
[0010] 本發(fā)明提供用于轉(zhuǎn)基因大豆品系呼交06-698的檢測(cè)方法的熒光探針，其核苷酸 序列如序列表SEQ IDNo. 3所示，5'端標(biāo)記有報(bào)告熒光基團(tuán)，3'端標(biāo)記有淬滅熒光基團(tuán)。
[0011] 其中，所述報(bào)告突光集團(tuán)選自Fam、Hex、Tet、Joe、Vic、Fite、Cy3、Cy5等中的一種。
[0012] 其中，所述淬滅突光基團(tuán)選自Tamra、Rox、Dabcy、Bhql、Bhq2、MGBNFQ等中的一種。
[0013] 本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)基因大豆品系呼交06-698的檢測(cè)方法，具體步驟如下：
[0014] 以待測(cè)大豆樣品的總DNA為模板，以一對(duì)特異性引物和熒光探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光 PCR擴(kuò)增，每個(gè)循環(huán)結(jié)束記錄熒光信號(hào)的數(shù)據(jù)，反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)數(shù)據(jù)繪制擴(kuò)增曲線，檢測(cè)到 熒光信號(hào)的則為轉(zhuǎn)基因大豆品系呼交06-698;
[0015] 所述一對(duì)特異性引物，其為：
[0016]正向引物：5' -TTCATTCAAAATAAGATCATACATACAGGTT-3'（如 SEQ IDNO. 1 所示）；
[0017]反向引物：5'-GGCATTTGTAGGAGCCACCTT-3'（如 SEQ IDNO.2所示）；
[0018] 所述熒光探針的核苷酸序列如序列表SEQ IDNo. 3所示，其5'端標(biāo)記有報(bào)告熒光 基團(tuán)，3'端標(biāo)記有淬滅熒光基團(tuán)。
[0019] 其中，所述實(shí)時(shí)熒光PCR的反應(yīng)體系如下：
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 用于轉(zhuǎn)基因大豆品系呼交06-698的檢測(cè)方法的一對(duì)特異性引物，其特征在于，其 為： 正向引物；5' -TTCATTCAAAATAAGATCATACATACAGGTT-3' 巧nSEQIDNO. 1 所示）； 反向引物；5' -GGCATTTGTAGGAGCCACCTT-3' 巧nSEQIDNO. 2 所示）。
2. 用于轉(zhuǎn)基因大豆品系呼交06-698的檢測(cè)方法的英光探針，其特征在于，其核巧酸序 列如序列表SEQIDNo. 3所示，5'端標(biāo)記有報(bào)告英光基團(tuán)，3'端標(biāo)記有渾滅英光基團(tuán)。
3. 如權(quán)利要求2所述的英光探針，其特征在于，所述報(bào)告英光集團(tuán)選自Fam、化X、Tet、 Joe、Vic、Fite、Cy3、C巧中的一種。
4. 如權(quán)利要求2所述的英光探針，其特征在于，所述渾滅英光基團(tuán)選自Tamra、Rox、 D油巧、Bhql、Miq2、MGBNFQ中的一種。
5. 轉(zhuǎn)基因大豆品系呼交06-698的檢測(cè)方法，其特征在于，具體步驟如下： W待測(cè)大豆樣品的總DNA為模板，W-對(duì)特異性引物和英光探針進(jìn)行實(shí)時(shí)英光PCR擴(kuò) 增，每個(gè)循環(huán)結(jié)束記錄英光信號(hào)的數(shù)據(jù)，反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)數(shù)據(jù)繪制擴(kuò)增曲線，檢測(cè)到英光信 號(hào)的則為轉(zhuǎn)基因大互?品系呼義06-698; 所述一對(duì)特異性引物，其為： 正向引物；5' -TTCATTCAAAATAAGATCATACATACAGGTT-3' 巧nSEQIDNO. 1 所示）； 反向引物；5' -GGCATTTGTAGGAGCCACCTT-3' 巧nSEQIDNO. 2 所示）； 所述英光探針的核巧酸序列如序列表SEQIDNo. 3所示，其5'端標(biāo)記有報(bào)告英光基團(tuán)， 3'端標(biāo)記有渾滅英光基團(tuán)。
6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述實(shí)時(shí)英光PCR的反應(yīng)體系如下： 特異性引物終濃度 0.2ymol/L 巧光探針終濃度 0.1nmol/L Mix 12.5^il DNA樣品終濃度 50ng/叫 Wdd&0補(bǔ)充反應(yīng)體系總體積至25y1。
7. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述實(shí)時(shí)英光PCR的反應(yīng)條件為： 5(TC2min;95°ClOmin;95°C15s、55°CImin，共 45 個(gè)循環(huán)。
8. 用于所述轉(zhuǎn)基因大豆品系呼交06-698檢測(cè)方法的試劑盒，其特征在于，包括下列組 分；摩爾比2:1的特異性引物對(duì)和英光探針。
9. 權(quán)利要求5-7任一項(xiàng)所述的方法在轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)中的應(yīng)用。
10. 權(quán)利要求8所述的試劑盒在轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種轉(zhuǎn)基因大豆品系呼交06-698的檢測(cè)方法，具體步驟為：以待測(cè)大豆樣品的總DNA為模板，以一對(duì)特異性引物和熒光探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，每個(gè)循環(huán)結(jié)束記錄熒光信號(hào)的數(shù)據(jù)，反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)數(shù)據(jù)繪制擴(kuò)增曲線，檢測(cè)到熒光信號(hào)的則為轉(zhuǎn)基因大豆品系呼交06-698。本發(fā)明還提供用于轉(zhuǎn)基因大豆品系呼交06-698的檢測(cè)方法的試劑盒。本發(fā)明的檢測(cè)方法準(zhǔn)確性高，反應(yīng)靈敏，可以快速檢測(cè)樣品是否含有轉(zhuǎn)基因大豆品系呼交06-698，為轉(zhuǎn)基因安全提供保障。
【IPC分類】C12Q1-68, C12N15-11
【公開號(hào)】CN104789646
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410028464
【發(fā)明人】付偉, 杜智欣, 彭萱子, 邱麗娟, 朱水芳
【申請(qǐng)人】中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院
【公開日】2015年7月22日
【申請(qǐng)日】2014年1月21日