一種基于一步pcr技術進行凡納濱對蝦遺傳性別鑒定的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于水產生物技術中的對蝦性別鑒定技術，具體地說，是一種時間快、成本 低、方法簡便的對蝦性別遺傳鑒別方法，適合在實驗室和育種基地進行大規(guī)模推廣。
【背景技術】
[0002] 凡納濱對蝦原產于中南美洲，野生種群分布在從墨西哥到智利的太平洋沿岸海 域，自1988年由中國科學院海洋研宄所的張偉權研宄員從美國夏威夷引進后，因其適應性 好，生長快，抗病力強，養(yǎng)殖速度發(fā)展很快，已成為我國沿海和內陸包括淡水地區(qū)的主要 養(yǎng)殖品種（李剛（2007).凡納濱對蝦選擇育種效應與生長規(guī)律的研宄碩士，西北農林科 技大學；于洋（2014).凡納濱對蝦分子標記的開發(fā)及其在遺傳育種中的應用博士，中國科 學院研宄生院（海洋研宄所））。在對蝦養(yǎng)殖過程中，主要影響對蝦產量的是生長速度和抗 病力，為了提高凡納濱對蝦的生長速度，科研人員進行了選擇育種、多倍體育種、雌核發(fā)育、 單性化群體培育等方面的研宄，（Farafidy(安迪）.凡納濱對蝦體重和體尺性狀的遺傳參 數和選擇育種效果研宄碩士，西北農林科技大學，2011.;朱春華，冉維亮，鄧思平，李廣 麗.環(huán)境因子對凡納濱對蝦性別分化的影響.水生生物學報2011，03:414-422;張彬，韋 嬪媛，熊建華，謝達祥，趙永貞，陳曉漢.凡納濱對蝦胚胎發(fā)育進程及誘導染色體加倍時 間確定.南方農業(yè)學報，2014, 04:664-670.)，由于對蝦雌雄性別的異質性，雌蝦的生長速 度顯著快于雄蝦，因此在生產中培育全雌的對蝦群體能夠顯著提高對蝦產量。
[0003] 為了培育對蝦全雌群體，需要首先明確對蝦的遺傳性別，并且需要在對蝦處于幼 蝦階段時就要進行性別的分析和鑒定，另外在全雌群體的培育試驗中，需要進行大量的性 別鑒定，因此需要建立一種快速、準確、成本低廉的對蝦性別分子鑒定方法。
[0004] PCR技術是一種非常成熟的分子生物學技術，也是用于分子鑒定的常用技術，本發(fā) 明利用雌雄對蝦差異的DNA序列，合理設計引物，使得僅在雌性個體中能夠擴增出條帶，而 在雄性個體中無條帶，利用這種特點，可以直接通過瓊脂糖凝膠電泳的方法進行檢測，不需 要貴重的基因分型儀器，結果重復性好，鑒定快、成本低。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的是針對凡納濱對蝦批量性別分子鑒定的需要，通過設計特異性PCR 引物，優(yōu)化反應體系，通過瓊脂糖凝膠電泳，即可實現(xiàn)凡納濱對蝦遺傳性別的分子鑒定。
[0006] 為實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明采用的方案為：
[0007] 提取對蝦的基因組DNA，使用一步PCR進行性別鑒定的引物進行擴增，PCR產物進 行電泳檢測，最后根據電泳結果進行對蝦性別鑒定。
[0008] 所述的對蝦基因組DNA提取方法采用天根植物基因組提取試劑盒中的說明書進 行。
[0009] -步PCR進行性別鑒定的引物對序列為：
[0010] LvSDASF ：AAGACAATGATTTTGAAG
[0011] LvSDASR :AAGAAACCGTGGGGGAAG。
[0012] 所述的PCR擴增體系為：脫氧核苷酸混合物（10mmol/L)0. 4yL，10XExTaq DNA 聚合酶緩沖液（TAKARA,日本）2.5yL，ExTaq DNA 聚合酶（2.5U/yL)0.5yL，LvSDPF* LvSDPR(10ymol/L)各 0.5yL，基因組 DNA 模板（50叩/1^)2 1^，雙蒸水補足2〇11匕
[0013] PCR 反應程序為 95°C 預變性 lOmin，擴增 35 個循環(huán)（95°C 30sec，53°C 30sec， 72°C 30sec)最后 72°C延伸 lOmin。
[0014] 所述的擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，步驟如下：
[0015] 首先制備1%瓊脂糖凝膠，并在瓊脂糖凝膠中加入DuRed (北京泛博生物化學有限 公司）核酸染料。
[0016] 在PCR產物中加入6X的上樣緩沖液，之后將PCR產物加入到瓊脂糖凝膠孔中， Marker選擇DL2000 (TAKARA，日本），100V電壓電泳20分鐘。
[0017] 電泳后的膠塊使用BioRed凝膠成像系統(tǒng)查看電泳結果，使用Quantity One(Bi 〇Red，美國）軟件獲得電泳結果（如附圖2所示）。
[0018] 所述的對蝦性別鑒定方法如下：根據電泳結果，如果電泳顯示個體在350bp處有 一特異性條帶，則該個體為雌性個體，如果電泳顯示個體在350bp處無條帶，則該個體為雄 性個體。
[0019] 該方法的優(yōu)點：
[0020] 該方法僅通過一步PCR后進行瓊脂糖電泳即可實現(xiàn)對蝦性別的鑒定，操作簡單， 成本低廉，基本的實驗室及育種基地即配備鑒定所需要的儀器設備，利于該方法的廣泛推 廣。另外該方法的重復性好，鑒定準確率高，是一種準確方便的鑒定方法。
【附圖說明】
[0021] 圖1 :一步PCR擴增進行性別鑒定結果，箭頭所示的350bp處的條帶為雌性個體特 異性條帶，其中個體2、3、4、9、10、11、12、18、19、20鑒定為雌性，其余個體鑒定為雄性。
[0022] 圖2 :-種基于一步PCR技術進行對蝦性別鑒定的方法。圖中電泳結果中雌性個 體均在350bp處有一條帶，而在雄性個體中350bp處沒有條帶。
【具體實施方式】
[0023] 實施例1 :一種基于一步PCR技術進行對蝦性別鑒定的方法
[0024] 具體步驟如下：
[0025] 1.對待分析的24個對蝦樣品進行取樣，取附肢或者肌肉組織30mg，并對每個個體 的組織進行標記。
[0026] 2.使用天根植物基因組DNA提取試劑盒提取上述樣品的DNA并標記，操作方法參 考說明書。提取的DNA使用NanodroplOOO (Thermol)測定DNA濃度。
[0027] 3.將提取的DNA使用如下引物進行PCR擴增：
[0028] LvSDPF ：AAGACAATGATTTTGAAG
[0029] LvSDPR :AAGAAACCGTGGGGGAAG〇
[0030] 其中的PCR擴增反應的總體積為25 yL，擴增反應體系為：脫氧核苷酸混合物 (10mmol/L)0.4yL，10XExTaq DNA 聚合酶緩沖液（TAKARA,日本）2.5yL，ExTaq DNA 聚合酶（2. 5U/ y L) 0? 5 y L, LvSDPF 和 LvSDPR (10 y mol/L)各 0? 5 y L，基因組 DNA 模板 (50ng/ y L) 2 y L，雙蒸水補足20 y L。PCR反應程序為95°C預變性lOmin，35個擴增循環(huán) (%°C 3〇sec，5：TC 3〇sec，72°C 3〇sec)最后 72°C延伸 10min〇
[0031] 4.對上述擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，步驟如下：
[0032] 首先制備1%瓊脂糖凝膠，并在瓊脂糖凝膠中加入DuRed (北京泛博生物化學有限 公司）核酸染料。
[0033] 在PCR產物中加入6X的上樣緩沖液，之后將PCR產物加入到瓊脂糖凝膠孔中， Marker 選擇 DL2000 (TAKARA)，100V 電壓電泳 20 分鐘。
[0034] 電泳后的膠塊使用BioRed凝膠成像系統(tǒng)查看電泳結果，使用Quantity One (BioRed，美國）軟件獲得電泳結果如附圖1所示。
[0035] 5.按照圖中所示，僅有一條帶的為雌性個體，沒有條帶的為雄性個體，因此圖1中 標示的個體2、3、4、9、10、11、12、18、19、20為雌性，其余個體為雄性。
【主權項】
1. 一種基于一步PCR技術進行凡納濱對蝦性別鑒定的方法，其特征是：提取對蝦的基 因組DNA，采用一對特異性引物進行一步PCR擴增，PCR產物進行電泳檢測，最后根據電泳結 果進行對蝦性別鑒定，在雌性個體的DNA中有特異性擴增產物，而在雄性個體中無特異性 擴增產物，即實現(xiàn)了對蝦的性別鑒定； 所述的特異性引物為： LvSDASF：AAGACAATGATTTTGAAG LvSDASR：AAGAAACCGTGGGGGAAG〇
2. 按照權利要求1所述的方法，其特征是：對蝦為凡納濱對蝦。
3. 按照權利要求1所述的方法，其特征是：PCR擴增的擴增體系如下： 脫氧核苷酸混合物（lOmmol/L) 0. 4yL，10XExTaqDNA聚合酶緩沖液（TAKARA，日 本）2.5yL，ExTaqDNA聚合酶（2. 5U/yL) 0.5yL,LvSDPF和LvSDPR(IOymoVL)各 0. 5yL，基因組DNA模板（50ng/yL) 2yL，雙蒸水補足25yL;PCR反應程序為95°C預變性 lOmin，擴增 35 個循環(huán)（95°C30sec，53°C30sec，72°C30sec)最后 72°C延伸IOmin0
4. 按權利要求I所述的方法，其特征是：所述電泳檢測是通過瓊脂糖凝膠電泳分析；根 據電泳結果實現(xiàn)對蝦的性別鑒定方法為：如果待分析個體的擴增產物經電泳后在350bp處 有一條特異帶，則該個體為雌性個體，如果電泳后無特異條帶，則該個體為雄性個體。
【專利摘要】本發(fā)明是一種通過一步PCR技術即可實現(xiàn)對蝦性別鑒定的方法，包括對蝦DNA的提取、一步PCR性別鑒定引物設計、一步PCR性別鑒定PCR擴增體系建立、PCR產物檢測及遺傳性別的鑒定。本實驗確立了用于性別鑒定的PCR引物和最佳條件，一步PCR性別鑒定引物在雌性個體會有擴增產物，而雄性個體無擴增產物，因此可以直接通過脂糖凝膠電泳即可對雌雄個體進行鑒定。本發(fā)明方法是一種快速、簡便、低成本的性別鑒定方法，鑒定中不需要昂貴的基因分型儀器，僅需要PCR儀和電泳儀，并且分析的時間快、成本低，適合大規(guī)模推廣。
【IPC分類】C12Q1-68
【公開號】CN104789691
【申請?zhí)枴緾N201510245995
【發(fā)明人】于洋, 李富花, 張曉軍, 相建海
【申請人】中國科學院海洋研究所
【公開日】2015年7月22日
【申請日】2015年5月14日