一種鑒別牛羊豬源性成分的引物組及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于食品檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種鑒別牛羊豬源性成分的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 自古以來"民以食為天"，"食"一直以來是人們?nèi)粘Ｉ钪斜夭豢缮俚囊徊糠?。隨 著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，肉類及其制品成為人們?nèi)粘Ｊ澄锏闹匾獊碓春徒M成部分。但是，國內(nèi)外 市場上肉食品安全性事件時(shí)有發(fā)生，"瘦肉精事件"、"三聚氰胺事件"、"假牛肉事件"和"馬 肉風(fēng)波"等食品問題層出不窮，同時(shí)帶來諸多社會(huì)問題。當(dāng)今，食品的豐富多樣化改變了外 觀和氣味，這也給肉類摻假者帶來了可乘之機(jī)。這些問題不但直接損害了消費(fèi)者的經(jīng)濟(jì)利 益，還可能引發(fā)一系列社會(huì)問題。因此，國家監(jiān)管部門先后頒布多項(xiàng)法律法規(guī)來規(guī)范動(dòng)物性 食品銷售的多個(gè)環(huán)節(jié)。在技術(shù)上，國家質(zhì)檢總局制定了一系列的標(biāo)準(zhǔn)方法用于牛、羊、豬等 物種成分的檢測，這對(duì)打擊摻假犯罪起到了一定作用。
[0003] 早期肉類鑒別依賴于感官和形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)，這些檢驗(yàn)方法準(zhǔn)確性低、局限度大，對(duì)于 深加工的肉類摻假基本無法鑒別。隨后發(fā)展了肉類形態(tài)學(xué)分析和成分鑒定方法，在這個(gè)過 程中基本確立了以特征性的蛋白和核酸作為靶標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行檢驗(yàn)的思路。如今形成了蛋白檢 驗(yàn)和DNA分析兩個(gè)不同的檢測方向，經(jīng)過20多年的發(fā)展，鑒別精度和靈敏度均有極大提高。 但是當(dāng)肉類經(jīng)過物理處理如切碎、混合、蒸煮和熏烤等過程后失去了原有形態(tài)和質(zhì)地，蛋白 質(zhì)鑒定技術(shù)不能滿足對(duì)這些樣品檢測的需要。因此，有必要提供一種簡便易行、準(zhǔn)確度更高 的檢測方法來檢測肉類成分。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種鑒別牛羊豬源性成分的引物組，包含有如下的引物：
[0005] 牛羊豬通用下游引物Seql :
[0006] TGGCTGGCACGAGATTTA(SEQ ID NO:l),
[0007] 牛羊通用上游引物Seq2 :
[0008] GCTGGACTTAACTGCATC(SEQ ID NO:2),
[0009] 豬特異性上游引物Seq3 :
[0010] ACGCCAATCTACCACAAA(SEQ ID N0:3)〇
[0011] 為了提高檢測的特異性，對(duì)上述的牛羊通用上游引物Seq2進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化后的 引物信息如下：
[0012] 牛羊通用上游引物 Seq2 優(yōu)選 1 :GCTGGACTTAACTGCAGC(SEQ ID N0:4)、
[0013] 牛羊通用上游引物 Seq2 優(yōu)選 2 :GCTGGACTTAACTGCCTC(SEQ ID N0:5)。
[0014] 上述的引物組，擴(kuò)增的牛、羊、豬源性成分的擴(kuò)增的片段大小分別為549bp、570bp 和 420bp。
[0015] 本發(fā)明還提供一種鑒別牛羊豬源性成分的試劑盒，使用上述的引物組；
[0016] 所述的試劑盒，還包含有如下的組分：
[0017] PCR Buffer A液：含有 lOOpM dNTP、2. OmM MgCl2、lXPCR buffer、50U/L Taq聚合 酶、0. 6yM牛羊豬通用下游引物Seql、0. 3yM牛羊通用上游引物Seq2、0. 3yM豬特異性上 游引物Seq3和雙蒸水；
[0018] Positive B液：含有陽性DNA模板（總濃度50ng/yL，等比混合牛、豬和綿羊基因 組 DNA。
[0019] Negative C 液：蒸餾水。
[0020] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，可以在一次PCR反應(yīng)中檢測牛、羊、豬三個(gè)物種，且具有 很高的穩(wěn)定性和靈敏性。相對(duì)更為復(fù)雜的多重PCR技術(shù)，三引物PCR在一定程度上減少了 誤差，更為重要的是一次PCR就可以鑒定豬牛羊三個(gè)物種，省時(shí)省力。本發(fā)明基于PCR技術(shù) 平臺(tái)，對(duì)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備要求不高，適于基層單位應(yīng)用。
【附圖說明】
[0021] 圖1 :是本發(fā)明對(duì)牛羊豬樣品的檢測結(jié)果。以中國荷斯坦牛、湖羊、美利奴羊、太湖 豬、長白豬的DNA為模板，擴(kuò)增測試所有待檢樣品擴(kuò)增性良好，混合樣品提取的DNA也完全 達(dá)到一致效果。圖中泳道編號(hào)備注如下：1 :DNA Marker ;2:牛；3 :羊；4 :豬；5 :牛羊豬；6 : 牛羊；7 :陰性對(duì)照。
【具體實(shí)施方式】：
[0022] 本發(fā)明經(jīng)過對(duì)豬、牛、羊及常見物種的mtDNA全序列做精細(xì)對(duì)比，以包含物種特異 性序列兩端的保守區(qū)為引物設(shè)計(jì)區(qū)域，擴(kuò)增區(qū)域序列由于存在插入-缺失片段而產(chǎn)物大小 不同，可在一步PCR中同時(shí)鑒定不同的物種，提高檢測效率。
[0023] 應(yīng)當(dāng)說明的是，本方法以綿羊基因組為參照設(shè)計(jì)完成，對(duì)山羊宜使用，具有與綿羊 源性成分同等檢測效果，但對(duì)山羊基因組擴(kuò)增產(chǎn)物長度為575bp。
[0024] 下面結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明的方法做進(jìn)一步說明。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí) 驗(yàn)方法，通常可按常規(guī)條件，如J.薩姆布魯克（Sambrook)等編寫的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中 所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件運(yùn)行。
[0025] 實(shí)施例1引物的設(shè)計(jì)及檢測
[0026] 1、引物的設(shè)計(jì)
[0027] 根據(jù)GenBank所公布的基因序列，以牛（JQ437479)、綿羊（NC_001941)和豬 (DQ534707)的線粒體DNA(mtDNA)全序列為模板，通過比對(duì)分析三個(gè)物種及常見動(dòng)物（雞、 鴨、兔、鼠、馬、狗）的mtDNA序列，根據(jù)其基因序列的特異性和保守性，設(shè)計(jì)特異性引物。同 時(shí)，為了避免牛羊豬近緣物種的非特異性擴(kuò)增，引入特異性錯(cuò)配堿基以提高PCR的特異性， 設(shè)計(jì)了兩條通用引物的優(yōu)選引物，分別在：T端倒數(shù)第二和第三個(gè)堿基引入G-A和C-T錯(cuò) 配。引物序列如表1所示。
[0028] 表1:引物序列信息
[0029]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種鑒別牛羊豬源性成分的引物組，其特征在于，所述的引物組包含有序列為SEQ IDNO: 1的牛羊豬通用下游引物、序列為SEQIDN0:2的牛羊通用上游引物和序列為SEQID N0:3的豬特異性上游引物。
2. 如權(quán)利要求1所述的引物組，其特征在于，所述的牛羊通用上游引物的序列為SEQ IDN0:4〇
3. 如權(quán)利要求1所述的引物組，其特征在于，所述的牛羊通用上游引物的序列為SEQ IDN0:5〇
4. 一種鑒別牛羊豬源性成分的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒使用權(quán)利要求1-3 任一項(xiàng)所述的引物組。
5. 如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包含有如下的組分： PCRBufferA液：含有IOOpMdNTP、2.0mMMgCl2、lXPCRbuffer、50U/LTaq聚合酶、 〇. 6yM牛羊豬通用下游引物、0. 3yM牛羊通用上游引物、0. 3yM豬特異性上游引物和雙蒸 水； PositiveB液：含有陽性DNA模板、 NegativeC液：蒸餾水。
6. 如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述的陽性DNA模板的濃度為50ng/yL。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種鑒別牛羊豬源性成分的引物組及試劑盒，包含有牛羊豬通用下游引物Seq1、牛羊通用上游引物Seq2和豬特異性上游引物Seq3。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，可以在一次PCR反應(yīng)中檢測牛、羊、豬三個(gè)物種，且具有很高的穩(wěn)定性和靈敏性。相對(duì)更為復(fù)雜的多重PCR技術(shù)，三引物PCR的在一定程度上減少了誤差，更為重要的是一次PCR就可以鑒定牛羊豬三個(gè)物種，省時(shí)省力。本發(fā)明基于PCR技術(shù)平臺(tái)，對(duì)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備要求不高，適于基層單位應(yīng)用。
【IPC分類】C12Q1-68, C12N15-11
【公開號(hào)】CN104789692
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510246313
【發(fā)明人】薛超波, 管峰, 李素芳, 王萍亞, 黃朱梁, 顧佳瑛, 林昕
【申請(qǐng)人】舟山市食品藥品檢驗(yàn)檢測研究院, 中國計(jì)量學(xué)院
【公開日】2015年7月22日
【申請(qǐng)日】2015年5月13日