一種從發(fā)酵液中分離純化γ-聚谷氨酸的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種從發(fā)酵液中分離純化γ-聚谷氨酸的方法，屬于工業(yè)微生物技術領域。
【背景技術】
[0002]γ -聚谷氨酸(γ-PGA)是一種由微生物合成的高分子氨基酸聚合物，其分子鏈上具有大量的活性較高的游離側(cè)鏈羧基(-COOH)，具有極高的吸水保濕性，易于和一些藥物結(jié)合生成穩(wěn)定的復合物，是一類理想的可生物降解的醫(yī)藥用高分子材料。其對環(huán)境無污染，為綠色生物產(chǎn)品，具極佳的生物可降解性、成膜性、成纖維性、可塑性、粘結(jié)性、保濕性等許多獨特的理化和生物學特性。在注重環(huán)保、強調(diào)可持續(xù)發(fā)展的今天，這種由生物合成的可降解型功能材料受到人們的青睞，正逐漸地被應用于醫(yī)藥制造，食品加工，蔬菜、水果、海產(chǎn)品的防凍、保鮮，也可開發(fā)應用于化妝品工業(yè)，煙草、皮革制造業(yè)及植物種子保護等許多領域，是一種有極大開發(fā)價值和廣闊前景的多功能新型生物制品。
[0003]1942年Bovarnick等人研宄發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌屬細菌能在培養(yǎng)基中積累γ-PGA，由此揭開了微生物發(fā)酵法生產(chǎn)γ-PGA的研宄歷史。目前，利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)γ-PGA—直是人們關注的熱點，相關研宄十分活躍。同化學合成法及酶轉(zhuǎn)化法相比，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)γ-PGA具有生產(chǎn)過程容易控制、發(fā)酵產(chǎn)量穩(wěn)定、提取率高、目標產(chǎn)物產(chǎn)量較高以及產(chǎn)物分子量適宜、環(huán)境友好等優(yōu)點，已逐步成為研宄和生產(chǎn)γ-PGA的主要方法和途徑。
[0004]通過微生物發(fā)酵得到的高粘度Y -聚谷氨酸發(fā)酵液，可通過有機溶劑沉淀法、化學沉淀法和膜分離沉淀法提取γ-聚谷氨酸。(I)有機溶劑沉淀法:一般采用有機溶劑(甲醇或乙醇)沉淀后，通過離心、干燥得到純品。細胞通過離心從發(fā)酵液分離出來，再通過冷凍干燥，加入4倍甲醇放置過夜沉淀離心收集粗品，粗品溶解于蒸餾水，離心去掉不溶性物質(zhì)。(2)化學沉淀法:化學沉淀法是用飽和硫酸銅、氯化鈉溶液代替低級醇類鹽析沉淀獲取γ-聚谷氨酸。(3)膜分離沉淀法:國內(nèi)有人選用截留分子量I萬的有機膜，取超濾壓力
0.06MPa進行膜過濾，也取得較好效果。膜分離技術是一種高效節(jié)能型分離技術，大多數(shù)膜分離過程在常溫下進行，無相變，不產(chǎn)生二次污染。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種簡單高效的從發(fā)酵液中分離純化γ -聚谷氨酸的方法，這種方法利用在低PH值發(fā)酵液濾液中只有γ-聚谷氨酸沉淀析出的特性，達到了分離純化高純度γ-聚谷氨酸的目的。本發(fā)明以控制pH值沉淀析出γ-聚谷氨酸的提取工藝為特征，解決了有機溶劑沉淀法提取γ -聚谷氨酸造成的有機溶媒損耗量高、工序長造成的生產(chǎn)成本較高且產(chǎn)品有有機溶劑殘留的問題。
[0006]本發(fā)明的技術方案是:一種從發(fā)酵液中分離純化γ -聚谷氨酸的方法，其特征是，發(fā)酵液用酸調(diào)ΡΗ3.0-6.0，過濾除菌，然后用活性炭脫色，再用酸調(diào)ρΗ2.0-5.0，靜置、析出沉淀，固液分離后用純化水溶解沉淀得高濃度水溶液，最后經(jīng)過帶式干燥、粉碎得到γ -聚谷氨酸成品。具體步驟如下:
[0007](I)發(fā)酵液預處理:將發(fā)酵液加熱至60-100°C (優(yōu)選70_90°C )，保溫0_2h (優(yōu)選l-2h)，降溫至0-60°C后調(diào)pH3.0-6.0 (優(yōu)選pH3.5-4.0)，通過板框過濾除掉菌體；然后調(diào)PH4.0-6.0，加熱至60-100°C (優(yōu)選80-90°C )，加入活性炭并保溫脫色O-1h (優(yōu)選0.5_lh)，脫色結(jié)束后板框過濾除活性炭，得到清濾液；
[0008](2)析出沉淀:將清濾液用鹽酸調(diào)pH2.0-5.0 (優(yōu)選pH2.5-3.0)，靜置0_24h (優(yōu)選10-24h)，析出沉淀，板框過濾得白色粉末，并用pH2.0-5.0(優(yōu)選pH2.5-3.0)的純化水(事先用鹽酸調(diào)好pH)洗至廢水無色澄清為止；
[0009](3)將白色粉末加入純化水，并調(diào)pH3.0-6.0 (優(yōu)選pH4.0-4.5)，攪拌溶解，得到濃度為20%以上的溶液；
[0010](4)再經(jīng)過帶式干燥、粉碎得到γ-聚谷氨酸成品。
[0011 ] 進一步的，所述步驟5)中帶式干燥工藝條件為加熱區(qū)溫度為60-95 V，進樣速度為 10-25L/h，履帶速度為 5-15cm/min。
[0012]其中，步驟(I)中的發(fā)酵液是以枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)FRD518CGMCCN0.6772為生產(chǎn)菌株，通過連續(xù)流加補料的方式發(fā)酵生產(chǎn)γ -聚谷氨酸，得到的發(fā)酵液，其γ_聚谷氨酸產(chǎn)量多65g/Lo具體發(fā)酵過程可見本申請人自己的發(fā)明專利申請201210555304.5 ;申請日:2012.11.02 ;發(fā)明名稱:一株產(chǎn)γ -聚谷氨酸基因工程菌及其高產(chǎn)rT _聚谷氨酸方法(見權利要求6及實施例5-6)。
[0013]本發(fā)明的機理為:本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)水可溶性的鈉型γ-聚谷氨酸在低PH值條件下可轉(zhuǎn)化為水不溶性的氫型γ-聚谷氨酸，而且，經(jīng)過處理的清濾液中只有γ-聚谷氨酸沉淀析出，可以得到高純度的γ-聚谷氨酸。利用這個特性對γ-聚谷氨酸提取工藝進行了改進，使γ-聚谷氨酸在常溫、無相變的條件下就被分離出來，收率達到85%以上，得到了純度達到95 %以上、無有機溶劑殘留的γ -聚谷氨酸產(chǎn)品。
[0014]本發(fā)明提供的一種從發(fā)酵液中分離純化Y-聚谷氨酸的方法，優(yōu)化了工藝，提高了產(chǎn)品質(zhì)量，具有如下特點:
[0015]1.以控制pH值沉淀析出Y-聚谷氨酸的提取工藝為特征，徹底取代了有機溶劑沉淀法在提取γ-聚谷氨酸工藝中的應用，解決了有機溶媒損耗量高、工序長造成的生產(chǎn)成本較高的問題；
[0016]2.控制pH值沉淀析出Y-聚谷氨酸的提取工藝很好的將產(chǎn)品和雜質(zhì)分開，提高了產(chǎn)品收率和純度，具有在常溫下進行、無相變、不產(chǎn)生二次污染、工藝簡便的優(yōu)勢；
[0017]3.本發(fā)明工藝路線新穎、簡單；完全不使用有機溶劑，產(chǎn)品無有機溶劑殘留；生產(chǎn)成本低，成本降低30%以上，更適合工業(yè)化生產(chǎn)；
[0018]4.最終γ-聚谷氨酸產(chǎn)品純度達95%以上，總收率達85%以上。產(chǎn)品為白色無定型粉末，質(zhì)量指標已達到化妝品級的要求。
【具體實施方式】
[0019]本實施例的發(fā)酵液為采用專利申請201210555304.5中的發(fā)酵方法，以枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)FRD518CGMCC N0.6772為生產(chǎn)菌株，通過連續(xù)流加補料的方式發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸得到的發(fā)酵液，其γ-聚谷氨酸產(chǎn)量為67.5g/L。
[0020]實施例1:
[0021](I)發(fā)酵液預處理:將發(fā)酵液加熱至90°C，保溫lh，降溫至60°C后調(diào)pH4.0，通過板框過濾除掉菌體，然后調(diào)PH5.0，加熱至80°C，加入活性炭并保溫脫色lh，脫色結(jié)束后板框過濾除活性炭，得到清濾液；
[0022](2)析出沉淀:將清濾液用鹽酸調(diào)pH2.5，靜置24h、析出沉淀，板框過濾得白色粉末，并用pH2.5的純化水洗至廢水無色澄清為止；
[0023](3)將白色粉末加入純化水，并調(diào)pH4.0，攪拌溶解，得到濃度為30%的溶液；
[0024](4)再經(jīng)過帶式干燥(帶式干燥工藝條件為加熱區(qū)溫度為75_85°C，進樣速度為15-20L/h，履帶速度為lOcm/min)、粉碎得到γ -聚谷氨酸成品，純度為96.5%，總收率
87.
[0025]實施例2:
[0026](I)發(fā)酵液預處理:將發(fā)酵液加熱至75°C，保溫2h，降溫至60°C后調(diào)pH3.5，通過板框過濾除掉菌體，然后調(diào)PH6.0，加熱至85°C，加入活性炭并保溫脫色0.5h，脫色結(jié)束后板框過濾除活性炭，得到清濾液；
[0027](2)析出沉淀:將清濾液用鹽酸調(diào)pH 3.0，靜置12h、析出沉淀，板框過濾得白色粉末，并用pH3.0的純化水洗至廢水無色澄清為止；
[0028](3)將白色粉末加入純化水，并調(diào)pH 4.5，攪拌溶解，得到濃度為40%的溶液；
[0029](4)再經(jīng)過帶式干燥(帶式干燥工藝條件為加熱區(qū)溫度為75_85°C，進樣速度為15-20L/h，履帶速度為lOcm/min)、粉碎得到γ -聚谷氨酸成品，純度為95.9%，總收率
88.
[0030]實施例3:
[0031](I)發(fā)酵液預處理:將發(fā)酵液加熱至80°C，保溫1.5h，降溫至60°C后調(diào)pH4.0，通過板框過濾除掉菌體，然后調(diào)PH6.0，加熱至85°C，加入活性炭并保溫脫色0.5h，脫色結(jié)束后板框過濾除活性炭，得到清濾液；
[0032](2)析出沉淀:將清濾液用鹽酸調(diào)pH 2.5，靜置18h、析出沉淀，板框過濾得白色粉末，并用pH2.5的純化水洗至廢水無色澄清為止；
[0033](3)將白色粉末加入純化水，并調(diào)pH 4.5，攪拌溶解，得到濃度為35%的溶液；
[0034](4)再經(jīng)過帶式干燥(帶式干燥工藝條件為加熱區(qū)溫度為75_85°C，進樣速度為15-20L/h，履帶速度為lOcm/min)、粉碎得到γ -聚谷氨酸成品，純度為96.2%，總收率88.
【主權項】
1.一種從發(fā)酵液中分離純化γ-聚谷氨酸的方法，其特征是，發(fā)酵液用酸調(diào)ΡΗ3.0-6.0，過濾除菌，然后用活性炭脫色，再用酸調(diào)ρΗ2.0-5.0，靜置、析出沉淀，固液分離后用純化水溶解沉淀得高濃度水溶液，最后經(jīng)過帶式干燥、粉碎得到γ -聚谷氨酸成品。
2.如權利要求1所述的一種從發(fā)酵液中分離純化γ-聚谷氨酸的方法，其特征是， (1)發(fā)酵液預處理:將發(fā)酵液加熱至60-100V，保溫0-2h，降溫至0-60 V后調(diào)PH3.0-6.0，通過板框過濾除掉菌體；然后調(diào)pH4.0-6.0，加熱至60_100°C，加入活性炭并保溫脫色Ο-lh，脫色結(jié)束后板框過濾除活性炭，得到清濾液； (2)析出沉淀:將清濾液用鹽酸調(diào)PH2.0-5.0，靜置0-24h，析出沉淀，板框過濾得白色粉末，并用PH2.0-5.0的純化水洗至廢水無色澄清為止； (3)將白色粉末加入純化水，并調(diào)pH3.0-6.0，攪拌溶解，得到濃度為20%以上的溶液； (4)再經(jīng)過帶式干燥、粉碎得到γ_聚谷氨酸成品。
3.如權利要求2所述的一種從發(fā)酵液中分離純化γ-聚谷氨酸的方法，其特征是，所述步驟(I)發(fā)酵液預處理為:將發(fā)酵液加熱至70-90°C，保溫l_2h，降溫至0-60°C后調(diào)PH3.5-4.0，通過板框過濾除掉菌體；然后調(diào)pH4.0-6.0，加熱至80-90°C，加入活性炭并保溫脫色0.5-lh，脫色結(jié)束后板框過濾除活性炭，得到清濾液。
4.如權利要求2所述的一種從發(fā)酵液中分離純化γ-聚谷氨酸的方法，其特征是，所述步驟(2)析出沉淀為:將清濾液用鹽酸調(diào)ρΗ2.5-3.0，靜置10-24h，析出沉淀，板框過濾得白色粉末，并用PH2.5-3.0的純化水洗至廢水無色澄清為止。
5.如權利要求2所述的一種從發(fā)酵液中分離純化γ-聚谷氨酸的方法，其特征是，所述步驟(3)白色粉末加入純化水，并調(diào)ρΗ4.0-4.5，攪拌溶解，得到濃度為20%以上的溶液。
6.如權利要求2-5中任意一項所述的一種從發(fā)酵液中分離純化γ-聚谷氨酸的方法，其特征是，所述步驟5)中帶式干燥工藝條件為:加熱區(qū)溫度為60-95?，進樣速度為10-25L/h，履帶速度為 5-15cm/min。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種從發(fā)酵液中分離純化γ-聚谷氨酸的方法。它利用在低pH值發(fā)酵液濾液中只有γ-聚谷氨酸析出的特性，達到了分離純化高純度γ-聚谷氨酸的目的。具體工藝為：用酸調(diào)pH3.0-6.0，過濾除菌，然后用活性炭脫色，再用酸調(diào)pH2.0-5.0，靜置、析出沉淀，固液分離后用純化水溶解沉淀得高濃度水溶液，最后經(jīng)過帶式干燥、粉碎得到γ-聚谷氨酸成品。本發(fā)明工藝路線新穎、簡單；完全不使用有機溶劑，產(chǎn)品無有機溶劑殘留；生產(chǎn)成本低，成本降低30％以上；收率高，達到85％以上；產(chǎn)品品質(zhì)好，純度達到95％以上，更適合工業(yè)化生產(chǎn)。
【IPC分類】C08G69-10
【公開號】CN104804183
【申請?zhí)枴緾N201510193843
【發(fā)明人】張林軍, 蘇移山, 馬雙雙, 朱云峰, 宗工理, 李珍愛, 劉英梅, 趙文剛
【申請人】山東福瑞達生物科技有限公司
【公開日】2015年7月29日
【申請日】2015年4月21日