一種微生態(tài)肥的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種微生態(tài)肥，屬于農(nóng)用肥料技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]微生物肥料的功效發(fā)揮主要是通過對(duì)傳統(tǒng)化肥、有機(jī)肥的增效作用，對(duì)土壤的改良活化作用，以及微生物的生理作用等方式來實(shí)現(xiàn)的。微生物肥是一種以微生物生命活動(dòng)及其產(chǎn)物導(dǎo)致農(nóng)作物得到特定肥料效應(yīng)的微生物活體制品，它在培肥地力、提高化肥利用率、抑制農(nóng)作物對(duì)重金屬及農(nóng)藥等有害物質(zhì)的吸收、凈化和修復(fù)土壤、促進(jìn)農(nóng)作物秸桿和城市垃圾的腐熟利用、提高農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)等方面有著不可替代的作用。
[0003]微生物肥料中有益微生物的種類、生命活動(dòng)是否旺盛是其有效性的基礎(chǔ)，而不像其它肥料是以氮、磷、鉀等主要元素的形式和多少為基礎(chǔ)。正因?yàn)槲⑸锓柿鲜腔钪苿?，所以其肥效與活菌數(shù)量、強(qiáng)度及周圍環(huán)境條件密切相關(guān)，包括溫度、水分、酸堿度、營(yíng)養(yǎng)條件及原生活在土壤中土著微生物排斥作用都有一定影響。
[0004]黑曲霉，廣泛分布于世界各地的糧食、植物性產(chǎn)品和土壤中，其產(chǎn)物對(duì)人體安全無害，是重要的發(fā)酵工業(yè)菌種。比如申請(qǐng)?zhí)枮椤?01110385820.3”的發(fā)明專利公開了一種黑曲霉進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵制備可溶性玉米肽，采用固態(tài)發(fā)酵在培養(yǎng)過程中無需震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)條件相較于液態(tài)發(fā)酵簡(jiǎn)單，可以大大提高產(chǎn)物的反應(yīng)效率、降低成本。
[0005]由于我國(guó)長(zhǎng)期在微生物肥料方面研究缺乏投入，使得我國(guó)的微生物肥料產(chǎn)業(yè)依然存在整體水平不高、技術(shù)創(chuàng)新不足、產(chǎn)品質(zhì)量與應(yīng)用效果表現(xiàn)欠穩(wěn)定的問題。在農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展已成為人類共識(shí)的今天，這些問題成了微生物肥行業(yè)函待打通的“瓶頸”。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題提供一種微生態(tài)肥的制備方法:
[0007]將以下重量份數(shù)的組分混合或混合后制粒:解磷巨大芽抱桿菌菌劑1-5份，枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物16-25份，黑曲霉培養(yǎng)物10-18份，植物乳桿菌劑5-12份。
[0008]所述枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物制備:從斜面轉(zhuǎn)接培養(yǎng)枯草芽孢桿菌，逐級(jí)擴(kuò)培后的種子液轉(zhuǎn)接入發(fā)酵罐中，發(fā)酵完畢發(fā)酵液經(jīng)過板框過濾、干燥后獲得含有枯草芽孢桿菌菌劑和酶制劑的培養(yǎng)物。
[0009]植物乳桿菌劑的制備方法:從斜面轉(zhuǎn)接培養(yǎng)植物乳桿菌，逐級(jí)擴(kuò)培后的種子液轉(zhuǎn)接入發(fā)酵罐中，發(fā)酵完畢發(fā)酵液經(jīng)低溫負(fù)壓真空濃縮到原體積的45%，得到菌濃縮液。添加載體:向濃縮液中添加混合好的載體，混合均勻；濃縮液與載體的重量比為0.5: 1，載體組成為:CaC0320-23份，糊精10-12份。流化床干燥，干燥溫度50°C。
[0010]黑曲霉培養(yǎng)物制備:菌種培養(yǎng)，固體發(fā)酵培養(yǎng):孢子液接種到固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)料中，26-33°C培養(yǎng)至菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)料，低溫流化床干燥，粉碎干燥物；采用常見固態(tài)發(fā)酵法制備獲得。
[0011]本產(chǎn)品使用方法簡(jiǎn)單，每畝地使用量0.3-1公斤，成本僅為80-100元/畝，拌種或生長(zhǎng)期灌水前地表噴灑。
[0012]有益效果
[0013]本發(fā)明的肥料營(yíng)養(yǎng)豐富，有機(jī)質(zhì)含量高。能夠滿足有機(jī)食品的生產(chǎn)需要。
[0014]本發(fā)明的肥料由復(fù)合微生物發(fā)酵而成，能夠改善土壤的微生態(tài)環(huán)境，為農(nóng)作物的生長(zhǎng)提供有益條件。
[0015]本發(fā)明的肥料能夠增強(qiáng)作物的抗病蟲害能力。
[0016]本發(fā)明的肥料能夠改良土壤。肥料中有益微生物能產(chǎn)生糖類物質(zhì)，占土壤有機(jī)質(zhì)的0.1%，與植物粘液，礦物胚體和有機(jī)膠體結(jié)合在一起，可以改善土壤團(tuán)粒結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)土壤的物理性能和減少土壤顆粒的損失，在一定的條件下，還能參與腐殖質(zhì)形成。所以施用微生物肥料能改善土壤物理性狀，有利于提高土壤肥力。
【具體實(shí)施方式】
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[0017]除非特別說明，本發(fā)明中所用的技術(shù)手段均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。另夕卜，實(shí)施方案應(yīng)理解為說明性的，而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求書所限定。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本發(fā)明實(shí)質(zhì)和范圍的前提下，對(duì)這些實(shí)施方案中的反應(yīng)條件、分離提取條件進(jìn)行的各種改變或改動(dòng)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0018]下面的實(shí)施例可以使本專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
[0019]解磷巨大芽抱桿菌是芽抱桿菌屬(Bacillus)中的一個(gè)種。運(yùn)動(dòng)，形成莢膜，好氧。從葡萄糖產(chǎn)酸，也常從阿拉伯糖和甘露醇產(chǎn)酸。水解淀粉，不產(chǎn)生卵磷脂酶，VP陰性。能分解土壤中的有機(jī)磷成為植物可利用的速效磷。
[0020]解磷巨大芽孢桿菌劑由滄州旺發(fā)生物技術(shù)研究所提供，地址:中國(guó)河北滄州市運(yùn)河區(qū)解放西路頤和國(guó)際商務(wù)中心A座I區(qū)807-812。
[0021]河北保定瑞谷生物科技有限公司提供膠質(zhì)芽孢桿菌菌粉。
[0022]本發(fā)明提供的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) L1-2013-02。該菌株已于2013年7月15日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址為:中國(guó)北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào))，保藏號(hào)為CGMCC N0.7926。
[0023]所述菌株特點(diǎn)如下:
[0024]所述菌株在固體平板上菌落顏色為乳白色，表面干燥不透明，邊緣整齊，為具有運(yùn)動(dòng)性的好氧菌。鏡檢為長(zhǎng)桿狀，革蘭氏染色呈陽性。該菌可利用檸檬酸鹽，硝酸還原、V-P實(shí)驗(yàn)成陽性。
[0025]所述枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)L1-2013-02由一株保藏于天津工業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室的產(chǎn)耐高溫α -淀粉酶的枯草芽孢桿菌L1-2013經(jīng)紫外線-氯化鋰-硫酸二乙酯復(fù)合誘變篩選獲得，具體篩選步驟如下:
[0026](I)菌懸液的制備
[0027]將在平板劃線分離后長(zhǎng)出的L1-2013單菌落接入種子培養(yǎng)基中，10r / min, 40°C培養(yǎng)12h后,取ImL培養(yǎng)液離心后用生理鹽水洗漆兩次,并重懸與9mL生理鹽水中。
[0028](2)紫外線-氯化鋰-硫酸二乙酯復(fù)合誘變
[0029]將菌懸液置于無菌平板中，在距離為30cm，功率15w的紫外燈下攪拌照射100s。將經(jīng)過照射的菌液經(jīng)梯度稀釋后涂布于氯化鋰平板，并以未經(jīng)紫外照射的菌液稀釋涂平板做對(duì)照。將上述涂布均勻的平板，用黑色的布或報(bào)紙包好，置40°C培養(yǎng)48h，在長(zhǎng)出菌落的平板上篩選出水解圈與菌落直徑比值最大者挑至斜面保存，純化后配制成菌懸液，經(jīng)梯度稀釋后與硫酸二乙酯原液充分混合，并于40°C震蕩處理40min，將處理過的菌液經(jīng)梯度稀釋后涂布于氯化鋰平板。
[0030](3)高產(chǎn)菌種的初篩
[0031]將上述涂布均勻的平板，置40°C培養(yǎng)48h，在長(zhǎng)出菌落的平板上初篩出水解圈與菌落直徑比值較大者挑至斜面保存，純化后獲得三株菌L1-2013-01，L1-2013-02,L1-2013-03
[0032](4)搖瓶發(fā)酵復(fù)篩
[0033]將獲得的三株菌L1-2013-01，L1-2013-02，L1-2013-03在含有30mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL搖瓶中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，種子接種量10% (V / V), 40 °C UOOr / min培養(yǎng)72h，離心取發(fā)酵上清液制得粗酶液。
[0034](5)酶活測(cè)定
[0035]酶活單位的定義:ImL粗酶液,于105°C、pH4.2條件下，Imin液化Img可溶性淀粉，即為I個(gè)酶活力單位，以U / mL表示。
[0036]經(jīng)測(cè)定，菌株L1-2013-02，為穩(wěn)定的最高產(chǎn)菌株，且酶活達(dá)到30000U / mL,比原始菌株酶活提高1.6倍。
[0037]所述氯化鋰平板:淀粉I %，蛋白胨 I %，(NH) 2S040.4 %，K2HPO40.8%, CaCl20.2%,氯化鋰0.9%,瓊脂2%。
[0038]所述的種子培養(yǎng)基:酵母粉0.5%，蛋白胨I %，可溶性淀粉I %，NaCl I %。
[0039]所述的發(fā)酵培養(yǎng)基:玉米粉5%?15%，豆餅粉4%?10%，(NH) 2S040.4 %,K2HPO40.8%, CaCl20.2%?
[0040]所述的搖瓶培養(yǎng)條件:該菌在含有30mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，接種量10%(V / V)，10r / min、40°C 發(fā)酵培養(yǎng) 72h。
[0041]由菌株L1-2013-02發(fā)酵獲得了一種耐高溫的α -淀粉酶，其酶學(xué)性質(zhì)如下:
[0042](I)該酶溫度適應(yīng)范圍較寬，最適作用溫度在105_115°C之間，且在110°C以下保存的溫度穩(wěn)定性較好，而115°C以上保存長(zhǎng)時(shí)間溫度穩(wěn)定性較差。
[0043](2)該酶最適反應(yīng)pH值為4.2。在pH值3.0_7.0之間均有較高酶活力，在pH值為3.0時(shí)酶活完全穩(wěn)定。
[0044](3)酶活性:由本發(fā)明所提供的突變株L1-2013-02，制備的耐高溫α -淀粉酶酶活力為 30000-35000U / ml。
[0045]1、本發(fā)明使用紫外線-氯化鋰-硫酸二乙酯復(fù)合誘變的方法獲得了一株高產(chǎn)耐高溫α -淀粉酶的枯草芽孢桿菌L1-2013-02，該菌株具有強(qiáng)耐酸、耐熱性，產(chǎn)酶活力高的特點(diǎn)。
[0046]2、有該菌株生產(chǎn)所得的耐高溫α -淀粉酶酶活力高達(dá)30000-35000U / ml,;適用溫度范圍為25-115°C，最適反應(yīng)溫度110°C，在110°C酶活完全穩(wěn)定；適用反應(yīng)pH值范圍為3.0-7.0，在pH值為3.0時(shí)酶活完全穩(wěn)定，最適反應(yīng)pH值為4.2，比現(xiàn)有的耐高溫α -淀粉酶酶活力高，酶作用最適PH值范圍寬泛，耐溫度高，特別適合反應(yīng)溫度高、液化工藝與糖化工藝并存的工業(yè)化需求。
[0047]本發(fā)明提供的黑曲霉Aspergillus niger L1-2013-03是由天津工業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室保臧的一株產(chǎn)纖維素酶的黑曲霉Aspergillus niger L1-2010經(jīng)亞硝基胍多輪誘變篩選，然后對(duì)優(yōu)良菌株經(jīng)發(fā)酵性能測(cè)試篩選得到產(chǎn)高活力纖維素酶的黑曲霉菌株Aspergillusniger L1-2013-03。
[0048]本發(fā)明提供的產(chǎn)高活力纖維素酶的菌株具體為黑曲霉Aspergillus nigerL1-2013-03。該菌株已于2013年7月15日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址為:中國(guó)北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，郵編100101)，保藏號(hào)為 CGMCC N0.7927。
[0049]本發(fā)明黑曲霉菌株Aspergillusniger L1-2013-03 (CGMCC N0.7927)具有以下微生物學(xué)特征:
[0050]1、形態(tài)學(xué)特征:
[0051]黑曲霉菌株CGMCC N0.7927，生物學(xué)形態(tài)為包括分生孢子、胞梗、頂囊、產(chǎn)胞結(jié)構(gòu)等幾部分。分生孢子頭球形至輻射形，直徑150-450 μ m，分生孢子梗發(fā)生于基質(zhì)。胞梗莖1000-3000 (長(zhǎng)度)X 12-20 (直徑)μ m，黃色或黃褐色，壁平滑；頂囊球形或近似球形，直徑45-75 μ m,表面全面可育；產(chǎn)胞結(jié)構(gòu)雙層，?；?0-20 (長(zhǎng)度)X 4.5-7.0 (直徑)μ m,瓶梗6-10 (長(zhǎng)度)X 2.5-3.5 (直徑)μ m，分生孢子球形或近球形，直徑3-4.5 μ m,褐色，壁粗糙。
[0052]2、培養(yǎng)學(xué)特征:
[0053]菌株在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)迅速，28 V 4天孢子可鋪滿斜面；質(zhì)地絲絨狀或稍帶絮狀；分生孢子結(jié)構(gòu)大量，褐黑色，無滲出液；菌落反面略帶黃色。
[0054]3、生理生化特征:
[0055]黑曲霉菌株CGMCC N0.7927可在玉米秸桿、稻草、木屑、馬鈴薯、玉米粉、可溶性淀粉、糖蜜等碳源上生長(zhǎng)，最適PH范圍5-6，最適生長(zhǎng)溫度范圍28-33°C，最適產(chǎn)酶溫度范圍28-30。。。
[0056]本發(fā)明黑曲霉菌株CGMCC N0.7927的篩選技術(shù)路線為:出發(fā)菌株一斜面培養(yǎng)一孢子懸液的制備一誘變處理一平板分離一初篩一復(fù)篩一遺傳穩(wěn)定性測(cè)定一擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)(發(fā)酵性能測(cè)定)。
[0057]按誘變篩選方案，對(duì)突變株逐級(jí)篩選淘汰，最后對(duì)優(yōu)良菌株經(jīng)發(fā)酵性