一種從蔥白中提取蔥酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于蔥白提取物的方法，具體涉及一種從蔥白中提取蔥酶的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]蔥白是百合科植物分蔥的鱗莖。蔥白中所含的化學(xué)成分主要是有機(jī)含硫化合物，其含量要比蔥葉高，且蔥白中有多種不飽和脂肪酸。中藥藥理學(xué)研宄表明，蔥白提取物具有抗心絞痛、抗動脈粥樣硬化、對心肌缺血再灌注影響以及對缺糖缺氧心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，能夠明顯改善冠心病心絞痛患者心絞痛發(fā)作的次數(shù)和程度；降血脂和膽固醇，抗氧化損傷，保護(hù)血管內(nèi)皮，減輕球囊損傷后再狹窄的功效，以其為原料的相應(yīng)產(chǎn)品的開發(fā)和應(yīng)用有著很好前景。與蔥屬另一物質(zhì)大蒜相似，蔥白中存在著一種酶，和其相應(yīng)有機(jī)硫化物底物，當(dāng)蔥白細(xì)胞破碎的條件下，二者即結(jié)合，反應(yīng)生成丙酮酸和硫代亞磺酸酯類物質(zhì)。硫代亞磺酸酯類化合物是蔥屬眾多植物中含硫化合物的前體物質(zhì)，也是該屬物質(zhì)中眾多生物活性的關(guān)鍵物質(zhì)。該物質(zhì)非常不穩(wěn)定，很容易分解為各種含硫化合物。我們前期已通過對蔥白進(jìn)行酶解和殺酶兩種不同方法處理后的比較，發(fā)現(xiàn)其含有機(jī)硫化合物出現(xiàn)明顯差異，因此對蔥白生物活性的研宄及開發(fā)利用過程中，對含硫化合物的前體物質(zhì)的研宄則成了關(guān)鍵之一，所以對其起重要作用的蒜氨酸酶的研宄具有重要的意義。
[0003]現(xiàn)階段，對蔥白同屬物質(zhì)一大蒜中蒜氨酸酶的研宄已經(jīng)很深入，但是關(guān)于蔥白中酶的研宄則鮮有報道。雖然這兩種物質(zhì)中含硫化合物產(chǎn)生的原理相似，兩種酶的功能也有一定的相似性，但是不同的酶之間，在理化性質(zhì)及酶動力學(xué)特性上存在著一定的差別。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種從蔥白中提取蔥酶的方法，以解決上述問題。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案是:
(1)取新鮮大蔥，洗凈晾干后，取蔥白50g加入250ml浸提液在_15°C的環(huán)境下靜置30小時，其中，浸提液由甲醇、三氯甲烷、水三者以60:25:15的比例混合而成；
(2)將浸提液與蔥白分離，置于分液漏斗中，加入10ml水和10ml三氯甲烷，靜置萃取，完全分層后去上層水相，濃縮去除甲醇，濃縮液用純化水定容至100ml，于4°C保存；
(3)將PH為6.5的Na-K磷酸鹽緩沖液+ 10%甘油，預(yù)冷12h后，加入濃縮液中，同時加入濃度為20umol.L — I的5’ 一磷酸吡哆醛，得到溶液a ；
(4)取溶液a，在一40°C的溫度下預(yù)凍3小時取出，解凍后；在_20°C的溫度下冷凍3小時取出，解凍后；在-OV的溫度下冷凍3小時取出，解凍后；在10°C下靜置3小時取出，冷卻后；在在20 °C下靜置3小時取出，冷卻后；在35°0下靜置3小時取出，冷卻，得到溶液b ;
(5)在4°C條件下，向溶液b中緩慢加入15%(m / v) PEG8000，持續(xù)攪拌30min，然后在4°C下，以轉(zhuǎn)速為8000r.min 一 I高速離心20min，棄上清，得蛋白質(zhì)沉淀物；
(6)將沉淀物用PH6.5的Na-K緩沖液溶解，裝入預(yù)處理好的透析袋中，于4°C條件下透析6h，每2h更換一次透析液，將透析處理過的蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行凍干處理。
[0006]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明的方法工藝簡單，得到的蔥酶純度高，有害雜質(zhì)殘留量少。
【具體實施方式】
[0007](I)取新鮮大蔥，洗凈晾干后，取蔥白50g加入250ml浸提液在-15°C的環(huán)境下靜置30小時，其中，浸提液由甲醇、三氯甲烷、水三者以60:25:15的比例混合而成；
(2)將浸提液與蔥白分離，置于分液漏斗中，加入10ml水和10ml三氯甲烷，靜置萃取，完全分層后去上層水相，濃縮去除甲醇，濃縮液用純化水定容至100ml，于4°C保存；
(3)將PH為6.5的Na-K磷酸鹽緩沖液+ 10%甘油，預(yù)冷12h后，加入濃縮液中，同時加入濃度為20umol.L — I的5’ 一磷酸吡哆醛，得到溶液a ；
(4)取溶液a，在一40°C的溫度下預(yù)凍3小時取出，解凍后；在_20°C的溫度下冷凍3小時取出，解凍后；在-OV的溫度下冷凍3小時取出，解凍后；在10°C下靜置3小時取出，冷卻后；在在20 °C下靜置3小時取出，冷卻后；在35°0下靜置3小時取出，冷卻，得到溶液b ;
(5)在4°C條件下，向溶液b中緩慢加入15%(m / v) PEG8000，持續(xù)攪拌30min，然后在4°C下，以轉(zhuǎn)速為8000r.min 一 I高速離心20min，棄上清，得蛋白質(zhì)沉淀物；
(6)將沉淀物用PH6.5的Na-K緩沖液溶解，裝入預(yù)處理好的透析袋中，于4°C條件下透析6h，每2h更換一次透析液，將透析處理過的蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行凍干處理。
【主權(quán)項】
1.一種從蔥白中提取蔥酶的方法，其特征在于，其包括以下步驟: (1)取新鮮大蔥，洗凈晾干后，取蔥白50g加入250ml浸提液在_15°C的環(huán)境下靜置30小時，其中，浸提液由甲醇、三氯甲烷、水三者以60:25:15的比例混合而成； (2)將浸提液與蔥白分離，置于分液漏斗中，加入10ml水和10ml三氯甲烷，靜置萃取，完全分層后去上層水相，濃縮去除甲醇，濃縮液用純化水定容至100ml，于4°C保存； (3)將PH為6.5的Na-K磷酸鹽緩沖液+ 10%甘油，預(yù)冷12h后，加入濃縮液中，同時加入濃度為20umol.L — I的5’ 一磷酸吡哆醛，得到溶液a ； (4)取溶液a，在一40°C的溫度下預(yù)凍3小時取出，解凍后；在_20°C的溫度下冷凍3小時取出，解凍后；在-OV的溫度下冷凍3小時取出，解凍后；在10°C下靜置3小時取出，冷卻后；在在20 °C下靜置3小時取出，冷卻后；在35°0下靜置3小時取出，冷卻，得到溶液b ; (5)在4°C條件下，向溶液b中緩慢加入15%(m / v) PEG8000，持續(xù)攪拌30min，然后在4°C下，以轉(zhuǎn)速為8000r.min 一 I高速離心20min，棄上清，得蛋白質(zhì)沉淀物； (6)將沉淀物用PH6.5的Na-K緩沖液溶解，裝入預(yù)處理好的透析袋中，于4°C條件下透析6h，每2h更換一次透析液，將透析處理過的蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行凍干處理。
【專利摘要】本發(fā)明屬于蔥白提取物的方法，具本發(fā)明蔥白中酶的方法操作，浸提30小時，加入Na-K磷酸鹽緩沖液和10％甘油，在－40℃的溫度下預(yù)凍3小時取出，解凍后；在-20℃的溫度下冷凍3小時取出，解凍后；在-0℃的溫度下冷凍3小時取出，解凍后；在10℃下靜置3小時取出，冷卻后；在20℃下靜置3小時取出，冷卻后；在35℃下靜置3小時取出，冷卻，在4℃條件下，加入15％（m／v）PEG8000，然后在4℃下，以轉(zhuǎn)速為8000r·min－1高速離心20min，棄上清，得蛋白質(zhì)沉淀物，將沉淀物用PH6.5的Na-K緩沖液溶解，裝入預(yù)處理好的透析袋中，于4℃條件下透析6h，每2h更換一次透析液，將透析處理過的蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行凍干處理，本發(fā)明簡便易行工藝質(zhì)量穩(wěn)定。
【IPC分類】C12N9-00
【公開號】CN104818255
【申請?zhí)枴緾N201510269340
【發(fā)明人】李躍
【申請人】安徽省懷遠(yuǎn)縣華夏藥械有限責(zé)任公司
【公開日】2015年8月5日
【申請日】2015年5月25日