一種藍藻基因組dna提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
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[0001]本發(fā)明屬于生物體的DNA提取技術(shù)，特別涉及一種藍藻基因組DNA提取方法。
【背景技術(shù)】
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[0002]為了監(jiān)測和預(yù)防藍藻水華，研宄相關(guān)藻類的產(chǎn)毒基因，提取其基因組DNA進行種屬鑒定和相關(guān)分子生物學(xué)研宄，已經(jīng)成為必要。目前藻類基因組DNA提取方法，主要有:CTAB法，裂解法，纖維素酶法，商品試劑盒提取方法等。上述報道的方法可以對藻類或野外混合水樣中的藻類基因組DNA進行直接提取，但存在以下問題:(I)提取時間長，約2?3小時；(2)提取方法操作繁瑣，不適合做高通量的研宄；(3)提取試劑復(fù)雜，成本高。XinZhanguo, et al (2003)報道了一種對植物基因組DNA的高通量提取方法，但未對藻類的DNA進行提取，提取DNA質(zhì)量是否滿足用于熒光定量PCR實驗未做說明(Xin Zhanguo, etal.B1Techniques,2003，34:820-826)。

【發(fā)明內(nèi)容】

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[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種解決現(xiàn)有技術(shù)問題的一種藻類基因組DNA提取方法，該方法可以高效，低成本的，高通量的提取藻類基因組DNA，用于PCR擴增、熒光定量PCR等相關(guān)分子生物學(xué)研宄。
[0004]本發(fā)明所述的藻類DNA提取方法，包括以下步驟:
[0005](I)離心收取10mg藻細胞于1.5ml Ep管中；
[0006](2)加入 50 μ L Buffer A，置于 95°C水浴中 1min ；
[0007](3)然后再加入50μ1 Buffer B，混勻，提取后的DNA樣品可以直接使用或置于-20°C的冰箱中保存；
[0008]其中，所述的Buffer A和Buffer B配方如下:
[0009](I) Buffer A: 10mM NaOH, 2% (w/v) Tween 20，需要新鮮配制；
[0010](2) Buffer B: 10mM Tris_HCl，2mM EDTA，用濃鹽酸調(diào) pH 至 2.0 ;
[0011 ] 利用本發(fā)明方法提取的藻基因組DNA，用于PCR和熒光定量PCR反應(yīng)時，除了加入PCR反應(yīng)所需要的適量濃度的上下游引物，dNTP，緩沖液，Mg2+，酶等試劑外，另外需要加A 0.01 % (w/v)牛血清蛋白(Bovine serum albumin，BSA), I % (w/v)聚乙稀卩比略燒酉同(Polyvinylpyrrolidone, PVP-30)。
[0012]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于:
[0013](I)大幅度縮短藻類基因組DNA提取時間，僅需20min左右。
[0014](2)大幅度降低藻類基因組DNA提取成本，降低提取成本2/3以上。
[0015](3)可以高通量的提取藻類基因組DNA，用于PCR擴增、熒光定量PCR等相關(guān)分子生物學(xué)研宄。
【附圖說明】
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[0016]圖1不同藍藻基因組DNA mcyE/ndaF和16S rDNA基因擴增
[0017]M DNA ladder(10bp takara) ; lFACHB_82Anabaena Sp ;2FACHB_5280sciIlatoriaSp ;3FACHB_1039Aphanizomenon flos-aque ；4FACHB-315Microcystis aeruginosa5FACHB-170Anabaena cylindrica ；6FACHB-1099Phormidium Sp ;7FACHB_245Anabanaf los-aque ；8FACHB-10530sci I latoria Sp ;瓊脂糖凝膠濃度 3%。
[0018]圖2 熒光定量 PCR 檢測產(chǎn)毒微囊藻 FACHB-315Microcystis aeruginosa
[0019]A 焚光定量 PCR 體系添加 0.1 % (w/v)牛血清蛋白(Bovine serum albumin, BSA)和1% (w/v)聚乙稀卩比略燒酮(Polyvinylpyrrolidone，PVP-30) ;B焚光定量PCR體系未添加0.1 % (w/v)牛血清蛋白(Bovine serum albumin，BSA)和I % (w/v)聚乙稀卩比略燒酉同(Polyvinylpyrrolidone, PVP-30)。
【具體實施方式】
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[0020]以下通過實施例對本發(fā)明做進一步描述:
[0021]實施例1:藻類基因組DNA提取
[0022]將不同藍藻藻種在相應(yīng)培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)后按以下方案提取藻類基因組DNA:
[0023](I)離心收取10mg藻細胞于1.5ml Ep管中；
[0024](2)加入 50 μ L Buffer A，置于 95°C水浴中 1min ；
[0025](3)然后再加入50μ1 Buffer B，混勻，提取后的DNA樣品可以直接使用或置于-20°C的冰箱中保存。
[0026]其中，所述的Buffer A和Buffer B配方如下:
[0027](I) Buffer A: 10mM NaOH, 2% (w/v) Tween 20，需要新鮮配制；
[0028](2) Buffer B: 10mM Tris_HCl，2mM EDTA，用濃鹽酸調(diào) pH 至 2.0 ;
[0029]DNA濃度和純度檢測:
[0030]分別取上述藻類基因組的DNA各5 μ 1，經(jīng)TE緩沖液稀釋，用紫外分光光度計測定Α260和Α280，按照如下公式計算DNA濃度:[DNA] = (Α260) X (0.05 μ g/ μ I) X稀釋倍數(shù)。結(jié)果表明用該方法提取的基因組DNA濃度為0.29 μ g/ μ 1，Α260/Α280為1.546。表明基因組中有少量蛋白質(zhì)污染。
[0031]實施例2:微囊藻毒素產(chǎn)毒基因mcyE/ndaF和16S rDNA PCR擴增
[0032]利用微囊藻毒素產(chǎn)毒基因mcyE/ndaF引物，進行PCR擴增，引物序列mcy-F:AATAAATCATAATTTAGAACSGGVGATTTAGG，mcy-R:AATAAATCATAACGRBTVADTTGRTATTCAATTTCT，擴增目標(biāo)片段大小128bp。
[0033]PCR 反應(yīng)體系如下:10 μ M mcy_F 和 mcy-R 引物，各 I μ L，110 X PCR buffer2.5 μ L, 25 μM dNTP 2 μ L, 15 μΜ MgCl2L 5 μ L,藻類基因組 DNA I yL,0.1 % (w/v)牛血清蛋白(Bovine serum albumin，BSA) 2.5 μ L，10 % (w/v)聚乙稀 P比略燒酉同(Polyvinylpyrrolidone, PVP-30) 2.5 yL，Tag 酶，0.5U，dd H2O 11 μ L，總體系 25 μ LqPCR 擴增程序為:94°C預(yù)變性4min，94°C變性30s，58°C退火lmin，72°C延伸30s，35個循環(huán)，72°C延伸 lOmin，10°C保溫 30min。
[0034]利用藻類熒光定量PCR引物，進行藻類基因組16S rDNA PCR擴增，引物序列16S-F:AGCCACACTGGGACTGAGACA，16S-R:TCGCCCATTGCGGAAA，擴增目標(biāo)片段大小 80bp 左右。
[0035]PCR 反應(yīng)體系如下:10 μ M 16S-F 和 16S-R 引物，各 I μ L，10XPCR buffer2.5 μ L, 25 μM dNTP 2 μ L, 15 μΜ MgCl2L 5 μ L,藻類基因組 DNA I yL,0.1 % (w/v)牛血清蛋白(Bovine serum albumin，BSA) 2.5 μ L，10 % (w/v)聚乙稀 P比略燒酉同(Polyvinylpyrrolidone, PVP-30) 2.5 yL，Tag 酶，0.5U，dd H2O 11 μ L，總體系 25 μ LqPCR 擴增程序為:94°C預(yù)變性4min，94°C變性30s，53°C退火lmin，72°C延伸30s，35個循環(huán)，72°C延伸 lOmin，10°C保溫 30min。
[0036]取5yL PCR產(chǎn)物在3%瓊脂糖凝膠進行電泳，結(jié)果見圖1。成功在產(chǎn)毒微囊藻藻FACHB-315Microcystis aeruginosa中擴增出128bp左右目的基因片段，并在所有藻種中均擴增出了 80bp的16S rDNA目標(biāo)條帶，無非特異性擴增。
[0037]實施例3:熒光定量PCR檢測產(chǎn)毒微囊藻FACHB-315Microcystis aeruginosa
[0038]利用微囊藻毒素產(chǎn)毒基因熒光定量PCR引物，進行PCR擴增，引物序列mcy_F:AATAAATCATAATTTAGAACSGGVGATTTAGG，mcy-R:AATAAATCATAACGRBTVADTTGRTATTCAATTTCT,擴增目標(biāo)片段大小128bp。
[0039]PCR 反應(yīng)體系如下:10 μ M mcy-F 和 mcy-R 引物，各 I μ L，10 μ L 2 X SYBR PremixEx Taq TM(Code:DRR041S)，藻類基因組 DNA I μ L, 0.1 % (w/v)牛血清蛋白(Bovineserum albumin，BSA)2.5 μL，10 % (w/v)聚乙稀 R比略燒酮(Polyvinylpyrrolidone,PVP-30) 2.5 μ L，dd H2O 2 μ L，總體系 20 μ L。PCR 擴增程序為:94°C預(yù)變性 4min，94°C變性30s，57°C退火 lmin，72°C延伸 30s，35 個循環(huán)，72°C延伸 lOmin，10°C保溫 30min。
[0040]qPCR擴增于ABI Step One Plus上進行，在退火過程中收集熒光。每個樣品實驗重復(fù)3次。熔解曲線的過程:95°C lmin，65°C lmin，從65°C開始每30s溫度升高0.5°C，結(jié)束溫度為95 °C。反應(yīng)結(jié)束后4°C保存。
[0041]熒光定量PCR檢測產(chǎn)毒微囊藻，見圖2。添加了牛血清蛋白(Bovine serumalbumin,BSA)和聚乙稀卩比略燒酮(Polyvinylpyrrolidone，PVP-30)的反應(yīng)體系，成功進行了焚光定量PCR反應(yīng)，檢測出產(chǎn)毒微囊藻FACHB-315Microcystis aeruginosa，而未添加這兩種試劑的，熒光定量PCR失敗，未能檢測出該藻。
【主權(quán)項】
1.一種藍藻基因組DNA提取方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)離心收取10mg藻細胞于1.5ml Ep管中；(2)加入50 μ L BufferA，置于 95°C 水浴中 1min ； (3)然后再加入50μ I BufferB，混勻，提取后的DNA樣品可以直接使用或置于-20°C的冰箱中保存； 其中，所述的Buffer A和Buffer B配方如下:(1)Buffer A: 10mM NaOH, 2% (w/v) Tween 20，需要新鮮配制；(2)Buffer B:10mM Tris_HCl，2mM EDTA，用濃鹽酸調(diào) pH 至 2.0。
2.利用本發(fā)明方法提取的藻基因組DNA，用于PCR和熒光定量PCR反應(yīng)時，除了加入PCR反應(yīng)所需要的適量濃度的上下游引物，dNTP，緩沖液，Mg2+，酶等試劑外，另外需要加A 0.01 % (w/v)牛血清蛋白(Bovine serum albumin，BSA), I % (w/v)聚乙稀卩比略燒酉同(Polyvinylpyrrolidone, PVP-30)。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種藍藻基因組DNA提取方法，屬于生物體的DNA提取技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明通過離心收取100mg藻細胞于1.5ml Ep管中，加入50μL Buffer A，置于95℃水浴中10min，然后再加入50μl Buffer B，混勻，提取后的DNA樣品可以直接使用或置于-20℃的冰箱中保存。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所述的藍藻基因組DNA提取方法，基因組DNA提取時間短，僅需20min左右；大幅度降低藻類基因組DNA提取成本，降低提取成本2/3以上；可以高通量的提取藻類基因組DNA，用于PCR擴增、熒光定量PCR等相關(guān)分子生物學(xué)研究。
【IPC分類】C12N15-10
【公開號】CN104818269
【申請?zhí)枴緾N201510267038
【發(fā)明人】劉洋
【申請人】湖州師范學(xué)院
【公開日】2015年8月5日
【申請日】2015年5月20日