一種小麥寡分蘗基因Ltn3的分子標(biāo)記HRM5及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及小麥分子育種領(lǐng)域，具體涉及一種小麥寡分蘗基因Ltn3的分子標(biāo)記 HRM5及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 小麥?zhǔn)俏覈鴥H次于水稻的第二大糧食作物，歷年種植面積分別占耕地面積的 22%~30%，糧食作物總面積的22%~27%，主要分布在河南、河北、山東、山西、陜西、江 蘇、四川、安徽等省份；總產(chǎn)量為1億噸以上，約占糧食作物產(chǎn)量的22%，是我國約一半人口 的主食，因此高產(chǎn)小麥品種的選育一直是育種家關(guān)注的重點(diǎn)。
[0003] 小麥產(chǎn)量性狀是復(fù)雜的數(shù)量性狀，受多個(gè)數(shù)量性狀基因位點(diǎn)（Quantitative traitlocus,QTL)控制，具有遺傳力低、受環(huán)境影響大、選擇難度高的特性，所以在選育過 程中，傳統(tǒng)的育種方法存在時(shí)間長(zhǎng)、消費(fèi)大、成本高、成果小的問題。分子標(biāo)記輔助育種是一 種采用與特定性狀相關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記作為輔助手段進(jìn)行育種的有效方法，具有不受環(huán)境條 件限制、在植物發(fā)育的整個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期均可檢測(cè)、選擇效率高等優(yōu)勢(shì)。
[0004] 小麥產(chǎn)量由三個(gè)主要因素構(gòu)成，即產(chǎn)量=穗數(shù)X穗粒數(shù)X粒重。分蘗是影響小 麥穗數(shù)進(jìn)而影響小麥產(chǎn)量的重要農(nóng)藝性狀之一，同時(shí)又是單子葉植物的一種特殊的分枝現(xiàn) 象，具有重要的研宄意義。
[0005] 小麥分蘗遺傳研宄總體進(jìn)展相對(duì)緩慢，現(xiàn)階段國內(nèi)外工作主要圍繞分蘗基因QTL 的分子標(biāo)記定位及其遺傳效應(yīng)開展。部分分蘗突變體由單基因控制，因而一些學(xué)者將 其作為質(zhì)量性狀來研宄（RichardsRA.Atillerinhibitiongeneinwheatandits affectonplantgrowth.AustrJAgricRes. 1988,39:749-757;DugganBL，Richards RA,TsuyuzakiH.Environmentaleffectsontheexpressionofthetiller inhibition(tin)geneinwheat.FunctPlantBiol，2002, 29:45 - 53)。同時(shí)，也有很多 學(xué)者將分蘗作為多基因控制的數(shù)量性狀來研究（ShahaMM，GillaKSJaenzigei*PS，Yen Y,KaepplercSM,AriyarathneHM.Molecularmappingoflociforagronomictraits onchromosome3Aofbreadwheat.CropSci. 1999, 39:1728-1732;謝現(xiàn)，龍海，侯永翠， 鄭有良.小麥寡分蘗材料H461分蘗性狀的遺傳分析.麥類作物學(xué)報(bào).2006, 26:21-23; 王巖.小麥永久F2群體構(gòu)建及株高和分蘗特性的QTL定位.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論 文，2009;溫明星.望水白多分蘗、矮稈突變體的鑒定及相關(guān)QTL定位.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)碩 士學(xué)位論文，2010;JinpengZhang,JunWu,WeihuaLiu，XiangLu，XinmingYang,Ainong Gao,XiuquanLi,YuqingLu，LihuiLi.Geneticmappingofafertiletiller inhibitiongene，ftin，inwheat.MolBreeding. 2013, 31:441-449)。迄今為止，已報(bào)道的 分蘗相關(guān)主效基因QTL位于1A，2A，3A，6A染色體，微效基因位于5A，3B，7B，1D、?染色體， 其中僅1A和3A上的tin基因研究較深入，完成了精細(xì)定位工作。
[0006] 小麥材料H461相對(duì)于小麥品種川農(nóng)16(國審品種）具有寡分蘗、多穗粒數(shù)、 多小穗數(shù)、高千粒重和高穗粒重等特性（侯永翠，鄭有良，蒲至恩，魏育明，李偉.穗數(shù) 型小麥新品種川農(nóng)16與大穗型寡分蘗品系H461遺傳差異研宄初報(bào).四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué) 報(bào).2003, 21:94-9)。同時(shí)，小麥品種川麥107和分蘗數(shù)顯著高于H461。因此，利用H461和 川麥107構(gòu)建遺傳研宄群體，進(jìn)一步驗(yàn)證小麥H461的寡分蘗特性，定位控制分蘗基因，尋找 緊密連鎖的分子標(biāo)記，促進(jìn)分蘗基因的圖位克隆，同時(shí)為小麥特異分蘗材料的創(chuàng)制及株型 育種提供新基因資源，進(jìn)一步利用分子標(biāo)記輔助選擇，將增強(qiáng)分蘗預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，提高株型 育種效率，加速實(shí)現(xiàn)增加小麥單產(chǎn)的目標(biāo)。
[0007] 分子標(biāo)記輔助選擇，不依賴于表現(xiàn)型選擇，即不受環(huán)境條件、基因間互作、基因型 與環(huán)境互作等多種因素的影響，而是直接對(duì)基因型進(jìn)行選擇，因而能大大提高育種效率。高 分辨熔解曲線（HighResolutionMelting,HRM)技術(shù)近年來國際上興起的一種SNP及突變 研宄工具。這種檢測(cè)方法具有操作簡(jiǎn)便、特異性好、高通量、快速、檢測(cè)成本低、結(jié)果準(zhǔn)確等 優(yōu)勢(shì)，并且實(shí)現(xiàn)了真正的閉管操作而受到普遍的關(guān)注。因此，篩選出與分蘗基因緊密連鎖 的，且適用于熒光定量PCR平臺(tái)HRM技術(shù)的分子標(biāo)記，不僅能對(duì)小麥分蘗基因進(jìn)行選擇，有 效調(diào)控小麥分蘗發(fā)生，塑造合理的分蘗發(fā)生群體，同時(shí)提高了選擇通量、速度和準(zhǔn)確性，解 決了大規(guī)模推廣應(yīng)用的技術(shù)瓶頸，對(duì)規(guī)?；牧夹←溣N群體質(zhì)量和產(chǎn)量具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于提供與小麥H461寡分蘗基因Ltn3緊密連鎖的分子標(biāo)記。
[0009] 本發(fā)明的另一目的在于提供所述分子標(biāo)記的熒光定量PCR引物。
[0010] 本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供上述寡分蘗基因Ltn3緊密連鎖的分子標(biāo)記的應(yīng) 用。
[0011] 本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0012] 本發(fā)明的新寡分蘗基因Ltn3來自小麥H461，該基因位于小麥2D染色體。Ltn3能 顯著降低小麥分蘗，L0D值大于5. 31，解釋約12%的表型變異。
[0013] 本發(fā)明所提供的分子標(biāo)記HRM5的核苷酸序列如SEQIDNo. 1所示。
[0014] 本發(fā)明所述分子標(biāo)記與小麥寡分蘗基因Ltn3共定位于小麥2D染色體，且與Ltn3 之間的遺傳距離為〇.35cM。
[0015] 本發(fā)明還提供了一種鑒定小麥寡分蘗基因Ltn3的分子標(biāo)記的方法，以待測(cè)植株 樣品的基因組DNA作為模板，用熒光定量PCR引物進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，利用擴(kuò)增結(jié)果進(jìn) 行基因型分型，將與H461分為同一類型的植株鑒定為含有小麥寡分蘗基因Ltn3的植株。
[0016] 可選的，所述方法包括以下步驟：
[0017] (1)以待測(cè)植株樣品的基因組DNA作為模板，用熒光定量PCR引物進(jìn)行熒光定量 PCR擴(kuò)增：
[0018] (2)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：SsoFast EvaGreen超混合液5 y L、上游引物和 下游引物各300ng、模板DNA 100ng、Dnaes/RNase-free去離子水加至總量為10 y L ;
[0019] (3)熒光定量PCR程序：95°C預(yù)變性5min;94°C變性15s、53°C退火30s，共50個(gè)循 環(huán)；熔解曲線范圍為65~95°C，每0.2°C讀一次數(shù)，時(shí)間為10s;
[0020] (4)利用步驟（3)獲得的結(jié)果進(jìn)行基因分型。
[0021] 其中，所述待鑒定植株的DNA取自小麥樣品三葉期的葉片。
[0022] 本發(fā)明還提供了所述分子標(biāo)記的熒光定量PCR引物，其中，上游引物序列如SEQID No. 2所示，下游引物序列如SEQIDNo. 3所示。
[0023] 本發(fā)明還提供了所述分子標(biāo)記HRM5在小麥育種中的應(yīng)用。
[0024] 本發(fā)明還提供了所述分子標(biāo)記HRM5在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用，其中，所述基因 為寡分蘗基因Ltn3。
[0025] 本發(fā)明還提供了本分發(fā)明所述方法在小麥育種改良中的應(yīng)用。
[0026] 本方還提供了所述的熒光定量PCR引物在分子標(biāo)記輔助小麥株型育種中的應(yīng)用。
[0027] 在本發(fā)明中，小麥寡分蘗基因Ltn3及分子標(biāo)記HRM5是通過以下方法獲得的：
[0028] (1)利用寡分蘗小麥H461作為母本，以小麥川農(nóng)16為父本雜交，得到雜種Fl，F(xiàn)1 代單株自交獲得F2,采用單粒傳法獲得含有223個(gè)株系的F8代RIL群體，隨機(jī)選擇188個(gè) 株系構(gòu)成遺傳作圖群體。
[0029] (2)用CTAB法提取所述的遺傳作圖群體的各株系的DNA，選取 wheatgenomics(http://wheatgenomics.plantpath.ksu.edu/)上公布的覆蓋六倍體小麥 A、B、D基因組的90KSNP芯片，以親本H461和川農(nóng)16的DNA為模版，進(jìn)行基因分型，獲得 所述RIL群體的基因型資料。親本H461的帶型記為A，親本川農(nóng)16的帶型記為B。F8群體 株系帶型來源于H461的記為A，來源于川農(nóng)16的記為B，雜合型為H。
[0030] (3)小麥成熟期田間鑒定所述F8群體植株的分蘗數(shù)。
[0031] (4)利用JoinMap4. 0作圖軟件將獲得的所述RIL群體基因型資料構(gòu)建小麥分子連 鎖圖譜，尋找最優(yōu)的標(biāo)記數(shù)和標(biāo)記順序，確定后續(xù)使用的連鎖群。利用軟件MapQTL6.0的 區(qū)間作圖模型（IntervalMapping)和多QTL作圖模型（MultipleQTLModel)，并結(jié)合F8 群體分蘗表型數(shù)據(jù)將寡分蘗基因Ltn3定位于2DL染色體上一個(gè)3. 49cM的區(qū)段內(nèi)。
[0032] (5)獲取該區(qū)段內(nèi)的SNP探針序列，通過在IWGSC小麥中國春的基因組測(cè)序數(shù)據(jù)， 獲得目標(biāo)區(qū)段更多的序列信息，電子延長(zhǎng)SNP探針序列兩端對(duì)應(yīng)的序列，并進(jìn)行序列分析， 初步篩選用于后續(xù)熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)的目標(biāo)區(qū)域。
[0033] (6)設(shè)計(jì)焚光定量PCR引物，用于后續(xù)篩選。利用BeaconDesigner7. 0軟件設(shè)計(jì) 熒光定量PCR引物10對(duì)（見表1)。熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)：引物長(zhǎng)度18~25bp，擴(kuò) 增產(chǎn)物長(zhǎng)度65~10(^口，退火溫度60°0,6(：含量在40%~60%之間，5即差異位點(diǎn)產(chǎn)物退 火溫度差異大于0.2 °C。
[0034] 表1 10對(duì)SSR引物序列及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度
[0035]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種小麥寡分蘗基因Ltn3的分子標(biāo)記HRM5,其特征在于，核苷酸序列如SEQID No. 1所示。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記，其特征在于，所述分子標(biāo)記與小麥寡分蘗基因 Ltn3共定位于小麥2D染色體，且與Ltn3之間的遺傳距離為0. 35cM。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的分子標(biāo)記，其特征在于，小麥寡分蘗基因Ltn3顯著降低 小麥分蘗，LOD值大于5. 31。
4. 一種鑒定小麥寡分蘗基因Ltn3的分子標(biāo)記HRM5的方法，其特征在于，以待測(cè)植株樣 品的基因組DNA作為模板，用熒光定量PCR引物進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，利用擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行 基因型分型，將與H461分為同一類型的植株鑒定為含有小麥寡分蘗基因Ltn3的植株。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 以待測(cè)植株樣品的基因組DNA作為模板，用熒光定量PCR引物進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò) 增； (2)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：Ss〇FastEvaGreen超混合液5yL、上游引物和下游 引物各300ng、模板DNA100ng、Dnaes/RNase-free去離子水加至總量為10yL; ⑶熒光定量PCR程序：95°C預(yù)變性5min;94°C變性15s、53°C退火30s，共50個(gè)循環(huán)； 熔解曲線范圍為65~95°C，每0.2°C讀一次數(shù)，時(shí)間為IOs; (4)利用步驟（3)獲得的結(jié)果進(jìn)行基因分型。
6. 權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述分子標(biāo)記的熒光定量PCR引物，其特征在于，上游引物 序列如SEQIDNo. 2所示，下游引物序列如SEQIDNo. 3所示。
7. 分子標(biāo)記HRM5在小麥育種中的應(yīng)用。
8. 分子標(biāo)記HRM5在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用，其中，所述基因?yàn)楣逊痔Y基因Ltn3。
9. 權(quán)利要求4或5所述的方法在小麥育種改良中的應(yīng)用。
10. 權(quán)利要求6所述的熒光定量PCR引物在分子標(biāo)記輔助小麥株型育種中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了與小麥寡分蘗基因Ltn3緊密連鎖的分子標(biāo)記HRM5，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，該分子標(biāo)記與小麥寡分蘗基因Ltn3的遺傳距離為0.35cM。檢測(cè)分析表明，該分子標(biāo)記能準(zhǔn)確跟蹤所述小麥寡分蘗基因，預(yù)測(cè)小麥的分蘗特性，進(jìn)而方便進(jìn)行分子設(shè)計(jì)育種。本發(fā)明還公開了一種鑒定小麥寡分蘗基因Ltn3的分子標(biāo)記的方法，利用本發(fā)明所提供的方法能夠加強(qiáng)分蘗預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，提高特異株型育種的成功率，加速實(shí)現(xiàn)增加小麥單產(chǎn)的目標(biāo)。
【IPC分類】C12N15-11, C12Q1-68
【公開號(hào)】CN104818271
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510222213
【發(fā)明人】劉亞西, 王智強(qiáng), 高尚, 石浩然, 莫洪君, 盧艷麗, 王益, 魏育明, 鄭有良
【申請(qǐng)人】四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年8月5日
【申請(qǐng)日】2015年5月4日