一次性檢測(cè)肺癌多重基因的引物、探針、檢測(cè)體系和試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及肺癌多重基因的引物、探針及檢測(cè)體系。
【背景技術(shù)】
[0002] 肺癌是惡性腫瘤中發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤之一，其中非小細(xì)胞肺癌 (NSCLC)占肺癌的85%左右。我國(guó)是肺癌發(fā)病率最高的國(guó)家，每年約有60萬(wàn)人被確診為肺 癌。在過(guò)去的30年里，肺癌的病死率增加了 464. 84%，據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO)估計(jì)，截至 2025年，我國(guó)每年肺癌死亡病例將達(dá)到100萬(wàn)。目前化療仍是肺癌最主要治療手段，雖然 隨著新一代化療藥物的出現(xiàn)，肺癌療效有了一定程度的提高，但肺癌患者的總生存率仍然 較低，究其原因，主要是大多數(shù)肺癌由于缺乏高靈敏度的基因突變檢測(cè)和確診技術(shù)以及與 之相匹配的科學(xué)的治療方案，從而失去了治療的最佳時(shí)機(jī)。近年來(lái)，分子靶向治療已經(jīng)成 為肺癌研究熱點(diǎn)，越來(lái)越多分子靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)及靶向藥物的研發(fā)給肺癌患者長(zhǎng)期生存帶來(lái)了 希望。隨著腫瘤個(gè)體化治療理念的提倡、分子檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步和靶向治療藥物的不斷推出， 肺癌核酸標(biāo)志物檢測(cè)指導(dǎo)治療方案引起了眾多學(xué)者的關(guān)注和探討，其研究熱點(diǎn)主要集中于 EGFR、BRAF、KRAS、ALK、R0S1 等靶點(diǎn)。
[0003] 目前，從法國(guó)報(bào)道的1000例的肺癌BM項(xiàng)目研究、美國(guó)LCMC項(xiàng)目等項(xiàng)目顯示肺癌 分子靶點(diǎn)的多基因檢測(cè)和篩查意義重大，有助臨床實(shí)踐和臨床試驗(yàn)，能顯著改善患者生存 質(zhì)量。然而，目前大多每次只能檢測(cè)一個(gè)突變或一段基因的突變，檢測(cè)通量低，只能逐個(gè)篩 查，耗時(shí)長(zhǎng)。同時(shí)，由于晚期患者取材較難，樣本量較少，往往不能滿足逐個(gè)篩查的需要，且 臨床上尚無(wú)能夠同時(shí)、一次性完成對(duì)此5個(gè)熱點(diǎn)基因進(jìn)行檢測(cè)的試劑盒。
[0004] 本發(fā)明提供一種高靈敏度和高特異性的用于一次性檢測(cè)多重肺癌基因的引物、探 針、試劑盒及引物分配方式。該檢測(cè)試劑盒利用DNA樣本進(jìn)行基因突變和RNA樣本進(jìn)行基 因融合的檢測(cè)，特異性和靈敏度高，檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性好，而且引入了熒光檢測(cè)技術(shù)，克服了 傳統(tǒng)PCR產(chǎn)物遺留污染的問(wèn)題，操作簡(jiǎn)便快捷，為臨床EGFR、BRAF、KRAS、ALK和R0S1基因 突變/融合的檢測(cè)提供了一種快速可靠的檢測(cè)方法。該方法可以實(shí)現(xiàn)一次性檢測(cè)肺癌的多 重基因，大大縮短了檢測(cè)的時(shí)間，提高了肺癌基因檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確率，從而實(shí)現(xiàn)指導(dǎo)肺 癌臨床治療方案制定及化療預(yù)后。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種用于一次性檢測(cè)多重肺癌基因的引物、探針，包括EGFR、BRAF、KRAS、ALK和R0S1等熱點(diǎn)基因的引物、探針及分配方式，其序列如表1 :
[0006] 表1引物、探針以及序列號(hào)
[0007]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一次性檢測(cè)肺癌多重基因的引物和探針，包括如下81條序列，且所述的序列分為12 組，具體如下：

O
2. -次性檢測(cè)肺癌基因檢測(cè)的反應(yīng)體系，包括 ①融合基因
其中，EARKB混合酶A的組成如下：
其中，所述的引物和探針如權(quán)利要求1所示。
3. 如權(quán)利要求2所述一次性檢測(cè)肺癌基因檢測(cè)的反應(yīng)體系，其特征在于，加入的EARKB 混合酶A的組成為Hs-taq酶0. 28 ii L、UNG酶0. 02 ii L、逆轉(zhuǎn)錄酶0. 5 ii L ;EARKB混合酶B 的組成為 Hs-taq 酶 0? 25 ii L、UNG 酶 0? 05 ii L。
4. 一種試劑盒，包括權(quán)利要求1所述的12組序列，這12組序列分別裝入12聯(lián)管內(nèi)。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一次性檢測(cè)肺癌多重基因的引物、探針、檢測(cè)體系及試劑盒，其中包括用于檢測(cè)肺癌EGFR基因18種突變、KRAS基因7種突變和BRAF V600E基因突變、ALK5種融合基因和ROS19種融合基因的引物、探針及其分配方式。本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒采用12聯(lián)PCR反應(yīng)條設(shè)計(jì)，每一個(gè)12聯(lián)PCR條檢測(cè)一個(gè)樣品的多重基因，12聯(lián)條的1-11管內(nèi)裝有相應(yīng)的檢測(cè)和內(nèi)控試劑，突變由FAM信號(hào)指示，內(nèi)控由HEX(或VIC)信號(hào)指示；12號(hào)管作為DNA提取質(zhì)量的外控檢測(cè)管，亦由FAM信號(hào)指示。本發(fā)明可以實(shí)現(xiàn)一次性檢測(cè)肺癌EGFR/KRAS/BRAF/ALK/ROS1基因，大大縮短了檢測(cè)的時(shí)間，靈敏度高，特異性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)便快捷，可為臨床醫(yī)生對(duì)肺癌患者選擇腫瘤靶向藥物治療提供參考。
【IPC分類】C12Q1-68, C12N15-11
【公開(kāi)號(hào)】CN104818318
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410313324
【發(fā)明人】黃蛤目, 林清華, 施偉杰, 江風(fēng)閣, 宋慶濤, 阮力, 鄭立謀
【申請(qǐng)人】廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司
【公開(kāi)日】2015年8月5日
【申請(qǐng)日】2014年7月2日