一種云紋石斑魚微衛(wèi)星標(biāo)記Epinmoss的檢測引物和方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于云紋石斑魚?oara)DNA分子遺傳標(biāo)記技術(shù)，涉及一種檢測云紋石斑魚微衛(wèi)星標(biāo)記Epinmoss的技術(shù)方法，具體是云紋石斑魚微衛(wèi)星標(biāo)記Epinmoss的檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]云級石叛免XEpirwphelus moara)屬鱸形目、鯧科、石斑魚屬，俗稱草斑、油斑，分布于北太平洋西部，我國產(chǎn)于東海和南海。它肉味鮮美，口感爽滑，蛋白質(zhì)含量高，營養(yǎng)豐富，深受廣大消費者青睞。云紋石斑魚生長快、適應(yīng)性強(qiáng)、經(jīng)濟(jì)價值高、適應(yīng)于池塘、網(wǎng)箱和室內(nèi)工廠化養(yǎng)殖。但云紋石斑魚自然資源量少，難以滿足人們的需求。2010年，中國水產(chǎn)科學(xué)研宄院黃海水產(chǎn)研宄所、福建省水產(chǎn)研宄所與煙臺市萊州明波水產(chǎn)公司聯(lián)合攻關(guān)，首次在我國北方獲得規(guī)?；庇晒?，為北方開展石斑魚養(yǎng)殖奠定了堅實的基礎(chǔ)。云紋石斑魚已成為我國目前最具發(fā)展?jié)摿Φ暮ＫB(yǎng)殖新品種之一。云紋石斑魚作為一種新興的養(yǎng)殖品種，遺傳學(xué)研宄相對薄弱，還沒有微衛(wèi)星標(biāo)記開發(fā)的報道。雖然同工酶標(biāo)記、RAPD標(biāo)記及AFLP標(biāo)記技術(shù)也可以用于研宄云紋石斑魚的遺傳結(jié)構(gòu)及其遺傳多樣性，然而由于這些標(biāo)記都屬于顯性遺傳標(biāo)記，檢測效率不如微衛(wèi)星標(biāo)記等共顯性標(biāo)記高。另外，同工酶標(biāo)記的缺點是多態(tài)性低，RAH)標(biāo)記的穩(wěn)定性不好，AFLP標(biāo)記操作繁瑣，這些都大大限制了它們的應(yīng)用。而微衛(wèi)星序列廣泛分布于真核生物基因組中，其特點是種類多，等位基因數(shù)目多，多態(tài)性高，共顯性，孟德爾遺傳方式，并隨機(jī)分布于基因組中，而且微衛(wèi)星標(biāo)記檢測效率高，結(jié)果穩(wěn)定。但由于缺乏云紋石斑魚微衛(wèi)星標(biāo)記，限制了其分子遺傳學(xué)研宄的發(fā)展，所以迫切需要獲取微衛(wèi)星標(biāo)記以進(jìn)行云紋石斑魚遺傳多樣性、個體識別和系譜認(rèn)證等方面的研宄和應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種高多態(tài)性的云紋石斑魚DNA分子遺傳標(biāo)記技術(shù)，即云紋石斑魚微衛(wèi)星標(biāo)記Epinmoss的快速檢測方法，以彌補已有技術(shù)的不足。
[0004]本發(fā)明的基本構(gòu)思主要是利用云紋石斑魚DNA序列中含有的微衛(wèi)星核心序列，在其兩端設(shè)計特異性引物并進(jìn)行PCR檢測，從而快速地檢測云紋石斑魚每個個體在此微衛(wèi)星區(qū)的遺傳變異，獲得該引物(微衛(wèi)星標(biāo)記Epinmoss)對云紋石斑魚的多態(tài)性圖譜，通過圖譜直觀地檢測出每個個體的基因型?；谏鲜霰尘艾F(xiàn)狀和實際要求，本發(fā)明從云紋石斑魚DNA序列中獲取了一個微衛(wèi)星標(biāo)記，命名為Epinmoss，該微衛(wèi)星標(biāo)記Epinmoss可用于云紋石斑魚遺傳多樣性分析和系譜認(rèn)證。
[0005]本發(fā)明是按照以下操作技術(shù)方案完成的:首先提取云紋石斑魚血液中的基因組DNA并稀釋備用；再利用云紋石斑魚基因組DNA序列中含有的微衛(wèi)星核心序列，在其序列兩端設(shè)計特異性引物；然后使用該引物對云紋石斑魚不同地理群或云紋石斑魚群內(nèi)個體的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，從而確定每個個體的基因型，獲得云紋石斑魚的遺傳多態(tài)性圖譜。
[0006]提取云紋石斑魚基因組DNA，將其稀釋為10ng/ μ I，每個PCR反應(yīng)中加入I μ 1，反應(yīng)總體積為25 μ I。
[0007]含有微衛(wèi)星序列的DNA序列為:
cgtggattat gcctgagagt atagtgtatt aacccctagg agagaacaaagcacctcatg gttaggagag ccagagacct tgccagtgtg tgtgtgtgtgtgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtatg gtgtgtgtgt gtgtgtgtgttctggaatgc ctggagacct ggacctgtgg gacaaggggc cttaatccatgagcat
其中微衛(wèi)星核心序列為:gtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtg tgtgtgtatggtgtgtgtgtgtgtgtgtgt
Epinmoss微衛(wèi)星引物序列為:
正鏈 5’ - CGTGGATTATGCCTGAGAGTATAGT-3’，
負(fù)鏈5’ -ATGCTCATGGATTAAGGCCCCTTGT-3’，使用該引物時的退火溫度為56°C。
[0008]微衛(wèi)星核心序列和引物序列是本發(fā)明的核心，在云紋石斑魚遺傳多樣性檢測中呈現(xiàn)多態(tài)性。
[0009]PCR擴(kuò)增的加樣參數(shù)為:每個PCR反應(yīng)總體積為25 μ 1，包括10ng云紋石斑魚基因組 DNA; 10 X PCR Buffer, 2.5 μ I ；Mg2+ 1.5mmol/L ;Tag 酶 Iu ;dNTP 各 0.1mmo I/L ;上述的弓丨物各1pmol JpddH2O至25 μ I。使用該引物時設(shè)置PCR儀的程序參數(shù)為:94°C變性2min ；94°C 30sec，56°C 45sec，72°C 40sec,該反應(yīng)進(jìn)行 35 個循環(huán)；72°C延伸 5 min，4°C保存。
[0010]PCR產(chǎn)物的檢測步驟:將PCR產(chǎn)物在8%的變性聚丙烯酰胺凝膠中以15W恒功率電泳1.5小時進(jìn)行分離。電泳結(jié)束后，首先用10%的冰醋酸溶液浸泡30min，然后蒸餾水沖洗5min，再以0.1 %的硝酸銀溶液浸泡30min，用3%的碳酸鈉溶液顯色5min，最后用10%的冰醋酸溶液浸泡5min，即可得到云紋石斑魚微衛(wèi)星標(biāo)記Epinmoss的多態(tài)性圖譜。
[0011]本發(fā)明的有益效果是可快捷的獲得云紋石斑魚的Epinmoss微衛(wèi)星標(biāo)記的遺傳變異圖譜，方法簡便。而且，相對于其它分子遺傳標(biāo)記技術(shù)而言，微衛(wèi)星標(biāo)記符合孟德爾遺傳模式，呈共顯性遺傳，所得結(jié)果可直觀地檢測出云紋石斑魚每個個體的基因型；而應(yīng)用于不同地理群或云紋石斑魚群內(nèi)個體間遺傳標(biāo)記、系譜認(rèn)證和遺傳圖譜的構(gòu)建等。
【附圖說明】
[0012]圖1是本發(fā)明微衛(wèi)星標(biāo)記Epinmoss對云紋石斑魚20個個體的檢測圖譜(編號1—20是云紋石斑魚的20個個體)。
【具體實施方式】
[0013]下面通過實施例詳細(xì)敘述本發(fā)明在云紋石斑魚Epinmoss微衛(wèi)星核心序列DNA分子遺傳標(biāo)記技術(shù)方法。首先提取云紋石斑魚血液中的基因組DNA并稀釋備用；再利用云紋石斑魚DNA序列中含有的微衛(wèi)星核心序列，在其序列兩端設(shè)計特異性引物；然后使用該引物對云紋石斑魚不同地理群或云紋石斑魚群內(nèi)個體的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，確定每個個體的基因型，即獲得云紋石斑魚的遺傳多態(tài)性圖譜。
[0014]1、云紋石斑魚基因組DNA的提取:將ΙΟΟμΙ云紋石斑魚血液加入Eppendorf管中，再加入細(xì)胞裂解液500μ1和20mg/ml的蛋白酶K 5μ1，輕輕搖勻，37°C過夜。然后在裂解好的樣品中加入600μ1酚氯:仿:異戊醇(25: 24: I)混合液，晃動20min后12000rpm離心lOmin，取上清液。再加入酚:氯仿:異戊醇混合液，重復(fù)上述操作3次。再取上清液，加入2倍體積冷卻的無水乙醇和1/10體積的3mol/L的醋酸鈉，12000rpm離心lOmin，棄去上清液，保留DNA沉淀，再用70 %乙醇洗滌該沉淀2次，待乙醇揮發(fā)完全后，以TE緩沖液溶解DNA，并稀釋為100ng/yl，4°C保存。
[0015]2、微衛(wèi)星引物的設(shè)計:在云紋石斑魚DNA序列基礎(chǔ)上，利用微衛(wèi)星DNA兩側(cè)的序列在同一物種相對于核心序列的高度保守性，據(jù)此在其兩端設(shè)計特異性引物，用其擴(kuò)增出該位點的微衛(wèi)星片段。由于微衛(wèi)星核心序列突變率相對較高，造成微衛(wèi)星DNA核心序列重復(fù)次數(shù)的增加或減少，即微衛(wèi)星DNA序列長度的變化，這是檢測微衛(wèi)星多態(tài)性的根源。本發(fā)明的微衛(wèi)星區(qū)核心序列兩端的特異性引物序列為:正鏈5’ - CGTGGATTATGCCTGAGAGTATAGT-3’，負(fù)鏈5’ - ATGCTCATGGATTAAGGCCCCTTGT _3’，使用該引物時的退火溫度為56°C。
[0016]3、PCR擴(kuò)增:首先加樣，加樣量如下:云紋石斑魚基因組DNA(100ng / L)，I μ I ;1XPCR Buffer, 2.5 μ I ；Mg2+ (25mmol / L)，1.5 μ I ;Taq 酶(5u / μ I)，0.2 μ I ;dNTP (各2.5mmo / L)，I μ I ;引物(各1pmol / μ I)，I μ I ;加滅菌水至25 μ I。其次，進(jìn)行PCR反應(yīng)，其 PCR 擴(kuò)增儀程序參數(shù)為:94°C變性 2min ；94°C 30sec，56°C 45sec，72°C 40sec，35 個循環(huán)；72°C延伸5min，4°C保存。
[0017]4、PCR產(chǎn)物的檢測:將PCR產(chǎn)物在8%的變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，電泳儀功率為15W，電泳時間為1.5小時左右。電泳結(jié)束后，首先用10%的冰醋酸溶液浸泡30min，然后蒸飽水沖洗5min，0.1%的硝酸銀溶液浸泡30min，3%的碳酸鈉溶液顯色5min，最后用10%的冰醋酸溶液浸泡5min即可得到云紋石斑魚在Epinmoss微衛(wèi)星核心序列的多態(tài)性圖譜，如圖1所示。結(jié)果可以看出，云紋石斑魚的20個個體共擴(kuò)增出8個等位基因，說明微衛(wèi)星標(biāo)記Epinmoss具有較高的多態(tài)性，適合進(jìn)行云紋石斑魚遺傳多樣性評估、分子生態(tài)學(xué)、個體識別等方面的研宄和應(yīng)用。
【主權(quán)項】
1.一組云紋石斑魚微衛(wèi)星標(biāo)記Epinm0ss的檢測引物，其特征在于，所述引物序列為:正鏈 5’ -CGTGGATTATGCCTGAGAGTATAGT-3’， 負(fù)鏈5’ - ATGCTCATGGATTAAGGCCCCTTGT-3’，用該標(biāo)記時的退火溫度為56°C。
2.—種云紋石斑魚微衛(wèi)星標(biāo)記Epinmoss的檢測方法，其特征在于，首先提取云紋石斑魚血液中的基因組DNA并稀釋備用；再利用云紋石斑魚DNA序列中含有的微衛(wèi)星核心序列，使用特異性引物對云紋石斑魚不同個體的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，從而確定云紋石斑魚不同個體在Epinmoss核心序列區(qū)的基因型，其中所述的云紋石斑魚微衛(wèi)星標(biāo)記Epinmoss即特異性引物為:正鏈 5’ -CGTGGATTATGCCTGAGAGTATAGT-3’， 負(fù)鏈5’ - ATGCTCATGGATTAAGGCCCCTTGT-3’，用該標(biāo)記時的退火溫度為56 °C。
3.如權(quán)利要求2所述的云紋石斑魚微衛(wèi)星標(biāo)記Epinmoss的檢測方法，其特征在于，對不同云紋石斑魚個體的基因組DNA進(jìn)行的PCR擴(kuò)增，其加樣參數(shù)為:每個PCR反應(yīng)總體積為25 μ 1，包括 10ng 云紋石斑魚基因組 DNA ； 10 XPCR Buffer, 2.5 μ I ；Mg2+ 1.5 mmol/L ；Taq酶Iu ;dNTP 0.lmmol/L ;權(quán)利要求1中的特異性引物各10 pmol ;最后加ddH20至25 μ I ;設(shè)置PCR儀的程序參數(shù)為:94°C變性5min ;94°C 45sec，56°C lmin，72°C 40sec，該反應(yīng)進(jìn)行35個循環(huán)；72°C延伸5 min，4°C保存。
4.如權(quán)利要求2所述的云紋石斑魚微衛(wèi)星標(biāo)記Epinmoss的檢測方法，其特征在于，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測的步驟:將PCR產(chǎn)物在8%的變性聚丙烯酰胺凝膠中以15W恒功率電泳1.5小時進(jìn)行分離，以10 %的冰醋酸溶液浸泡30min，然后蒸餾水沖洗5min，再以0.1 %的硝酸銀溶液浸泡30min，用3%的碳酸鈉溶液顯色5min，最后用10%的冰醋酸溶液浸泡5min。
5.權(quán)利要求2-4所述的方法在云紋石斑魚群體間遺傳多態(tài)性圖譜構(gòu)建上的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種云紋石斑魚微衛(wèi)星標(biāo)記Epinmoss的檢測引物和方法。首先提取云紋石斑魚血液中的基因組DNA并稀釋備用；再利用云紋石斑魚DNA序列中含有的微衛(wèi)星核心序列設(shè)計特異性引物；然后使用該引物對云紋石斑魚不同地理群或云紋石斑魚群內(nèi)個體的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測；利用產(chǎn)物出現(xiàn)的條帶進(jìn)行分析，確定每個個體的基因型，并獲得云紋石斑魚的遺傳多態(tài)性圖譜。本發(fā)明可快捷的獲得云紋石斑魚遺傳標(biāo)記Epinmoss的遺傳變異圖譜，方法簡便，所得結(jié)果可直觀地檢測出云紋石斑魚每個個體的基因型；應(yīng)用于不同地理群或云紋石斑魚群內(nèi)個體間遺傳標(biāo)記、系譜認(rèn)證和遺傳圖譜的構(gòu)建等。
【IPC分類】C12N15-11, C12Q1-68
【公開號】CN104818341
【申請?zhí)枴緾N201510291450
【發(fā)明人】劉云國, 劉凌霄
【申請人】煙臺大學(xué)
【公開日】2015年8月5日
【申請日】2015年6月1日