一種風(fēng)疹病毒重組蛋白及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及基因工程領(lǐng)域，特別是一種在大腸桿菌系統(tǒng)中表達(dá)重組風(fēng)疹病毒抗原 的融合蛋白及其應(yīng)用和生產(chǎn)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 孕婦在懷孕早期感染風(fēng)疹病毒（rubellavirus，RV)，其嚴(yán)重性可引起胎兒的先天 性風(fēng)疹綜合征（eongenitMrubellasyn化ome，CRS)，致使胎兒先天性致崎。不僅如此，兒 童和青少年感染風(fēng)疹病毒，雖可治愈，但亦可引起如風(fēng)疹病毒進(jìn)行性腦炎等罕見的并發(fā)癥。 而且經(jīng)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)，兒童和青少年感染風(fēng)疹病毒常能引起局部的爆發(fā)流行。因此，對(duì)孕婦 及易感人群等及時(shí)進(jìn)行風(fēng)疹病毒感染篩查，不僅對(duì)提高人口素質(zhì)，加快優(yōu)生計(jì)劃的進(jìn)一步 實(shí)施，也對(duì)提高成人生殖健康，預(yù)防后天感染等具有現(xiàn)實(shí)意義。
[0003] 現(xiàn)階段國內(nèi)外開展的風(fēng)疹病毒篩查的主要方法為化ISA檢測血清中特異性IgM抗 體，但風(fēng)疹病毒ELISA試劑盒所使用的抗原多為細(xì)胞培養(yǎng)抗原，其來源受到制約，而且純度 不高，容易造成檢測結(jié)果的靈敏度及特異性不高。風(fēng)疹病毒結(jié)構(gòu)蛋白的E1糖蛋白含有T、B 淋己細(xì)胞抗原表位，是RV表面的主要祀抗原，也是研制疫苗的理想祀蛋白。目前大多生產(chǎn) 原料公司在風(fēng)疹病毒重組抗原中所取片段僅為E1，存在諸多方面的缺點(diǎn)，極容易造成最終 診斷產(chǎn)品的假陽性和漏檢現(xiàn)象。
[0004] 盡管大多數(shù)中和抗體結(jié)合表位位于E1蛋白，但事實(shí)上可能很多新近感染RV的病 人也會(huì)產(chǎn)生抗另外的病毒蛋白成份。因此重組蛋白用于RV感染診斷具有很大潛力。
[0005] 本發(fā)明旨在針對(duì)風(fēng)疹病毒融合抗原進(jìn)行重組表達(dá)，W期用次抗原做為檢測風(fēng)疹病 毒抗體的核屯、原料。
[0006] 體外診斷核屯、原料的開發(fā)則是開發(fā)相應(yīng)診斷試劑的先決條件，只有開發(fā)出具有高 活性，高性能的抗原抗體，體外診斷試劑產(chǎn)品才能成為現(xiàn)實(shí)。因此，針對(duì)風(fēng)疹病毒抗原開發(fā) 出能夠用W生產(chǎn)診斷試劑的原料迫在眉睫。從某種程度上說，原料的開發(fā)也必將成為降低 風(fēng)疹病毒感染首要解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明目的在于提供一種風(fēng)疹病毒抗原的重組蛋白，此重組蛋白是利用基因工程 重組技術(shù)，在大腸桿菌系統(tǒng)中表達(dá)的重組風(fēng)疹病毒抗原，具有生產(chǎn)周期短，產(chǎn)量高，成本低 的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的風(fēng)疹病毒的融合蛋白可做為風(fēng)疹病毒免疫診斷試劑盒的一部分。
[000引一種風(fēng)疹病毒重組蛋白，其特征在于，所述風(fēng)疹病毒重組蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO. 1 所示。
[0009] 沈QIDNO. 1 ;PLLATSSTLTRPPGSSSIQRPGPSGNGSRFANAI化TARGLWGPRQSV。
[0010] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供上述風(fēng)疹病毒重組蛋白在制備風(fēng)疹病毒抗體檢測 試劑盒中的應(yīng)用。
[ocm] 本發(fā)明還提供了編碼SEQIDNO. 1的風(fēng)疹病毒重組蛋白基因，其核巧酸序列如SEQ IDNO. 2 所示。
[0012] 沈QIDNO. 2;CCCTTGCTAGCTACGTCCAGCACCCTCACAAGACCGCCCGGGTCAAGTTCCATACAG AGACCAGGACCGTCTGGCAACGGATCCCGGTTTGCCAACGCCATTCCCCTGACTGCTCGCGGCTTGTGGGGGCCACG CCAGAGCGTC。
[0013] 本發(fā)明的第=個(gè)目的是提供含有風(fēng)疹病毒重組蛋白基因的重組載體，其特征在 于，在質(zhì)粒pMa^c2x中包含有SEQ ID NO. 2核巧酸序列。
[0014] 本發(fā)明最后一個(gè)目的在于提供了上述重組載體的蛋白表達(dá)方法，其特征在于，其 表達(dá)時(shí)的誘導(dǎo)溫度在37度，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)速為2(K)巧m，誘導(dǎo)的IPTG濃度為ImM。
[0015] 本發(fā)明重組蛋白基因由人工合成。所用的載體為pMa^c2x，為氨節(jié)抗性，融合表達(dá) 麥芽糖結(jié)合蛋白MBP，蛋白定位于細(xì)胞周質(zhì)。
[0016] 本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)為大腸桿菌化21表達(dá)系統(tǒng)，它具有周期短，費(fèi)用低，表達(dá)量大 等特點(diǎn)。
[0017] 為了使得重組蛋白更好的保持活性位點(diǎn)，本發(fā)明選擇比較溫和的培養(yǎng)和誘導(dǎo)條 件，其表達(dá)時(shí)的誘導(dǎo)溫度在37度，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)速為2(K)巧m，誘導(dǎo)的IPTG濃度為0. 3mM。該樣使 得重組蛋白有了更加緩慢的表達(dá)，有充分的時(shí)間進(jìn)行空間構(gòu)象的形成。
[0018] 本發(fā)明可W采用超聲的方式破碎細(xì)菌。在破碎菌體的時(shí)候，為了避免太過劇烈，將 破碎條件定為200W，超聲3s，間隔6s超聲一次，共180次。
[0019] 本發(fā)明重組蛋白的純化方式可W有多種，例如離子交換層析，凝膠過濾層析和親 和層析等方法。本發(fā)明優(yōu)選親和層析，因?yàn)橹亟M蛋白中本發(fā)明加入了MBP標(biāo)簽，一步純化能 夠達(dá)到較高的純度。
[0020] 本發(fā)明對(duì)風(fēng)疹病毒抗原表位進(jìn)行重組表達(dá)，該樣就既保留了E1的主要抗原決定 簇位，進(jìn)而有效的避免了假陰性即漏檢現(xiàn)象，同時(shí)也去掉了一些非決定簇序列，提高產(chǎn)品穩(wěn) 定性，降低產(chǎn)品假陽性風(fēng)險(xiǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 實(shí)施例1含有風(fēng)疹病毒重組基因表達(dá)載體的構(gòu)建
[002引 由上海捷瑞生物工程有限公司合成重組基因序列SEQIDNO. 2,載體為pMa^c2x。
[0023]沈QIDNO. 2;CCCTTGCTAGCTACGTCCAGCACCCTCACAAGACCGCCCGGGTCAAGTTCCATACAG AGACCAGGACCGTCTGGCAACGGATCCCGGTTTGCCAACGCCATTCCCCTGACTGCTCGCGGCTTGTGGGGGCCACG CCAGAGCGTC。
[0024] 實(shí)施例2含有風(fēng)疹病毒重組蛋白的表達(dá)
[0025] 將合成好的風(fēng)疹病毒重組蛋白質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌化21中，涂布于含lOOug/ml 氨節(jié)青霉素（sigma,貨號(hào)；A9518)的LB平板上，37度過夜培養(yǎng)，挑取單克隆菌落，用含有相 同濃度的氨節(jié)青霉素的300mlLB培養(yǎng)基37度培養(yǎng)至0D600達(dá)0. 6左右，用終濃度為0. 3mM 的IPTG(上海生工，貨號(hào)JB0168)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)條件為；37度，轉(zhuǎn)速2(K)巧m，化。誘 導(dǎo)之后，將培養(yǎng)液4度，轉(zhuǎn)速7000巧m，離屯、lOmin，收集菌體。
[0026] 實(shí)施例3含有風(fēng)疹病毒重組蛋白的純化及復(fù)性
[0027]用 50ml上樣緩沖液BindingBuffer(50mMTris，0. 5MNacl，lmMEDTA， p服.0) 50ml破碎菌體，然后超聲破碎，條件為200w，超聲3s，間隔6s，共180次，最后 12000巧m，30min，4度離屯、收集上清，目的蛋白在上清中。接著過Amylose柱一步純化，用洗 脫緩沖液ElutionBuffer(50mMTris，0.5M化cl，lmM邸TA，10mMMaltose,P服.0)洗脫目 的蛋白。將純化后的重組蛋白用透析緩沖液巧OmMTris，0. 5M化cl，lmM邸TA，p服.0)透 析，每隔1化換一次透析液，共3次。取出透析后的蛋白液，經(jīng)0. 22um濾器過濾后，用lowry 法測定濃度后，于-20度保存?zhèn)溆谩?br>[002引實(shí)施例4本發(fā)明的風(fēng)疹病毒重組蛋白作為風(fēng)疹病毒診斷試劑的免疫反應(yīng)性
[0029] 4. 1風(fēng)疹病毒重組蛋白-HRP復(fù)合物的制備
[0030]按照pierce EZ-link plus activated peroxidase kit(貨號(hào) 31489)進(jìn)行操作。
[0031] 4. 2特異性
[0032] 1000份風(fēng)疹陰性血清分別每孔50ul包被酶標(biāo)板，4°C過夜后（大于8小時(shí)），用 PBST(10mMPB，150Mm化C1，0. 05%tween20,抑7. 4)洗板 3 次，然后用 1%BSA封閉，4°C 過夜（大于8小時(shí)），甩掉封閉液，拍干板子。每孔加入用PBST稀釋的風(fēng)疹病毒重組蛋 白-HRP復(fù)合物（1 ;5000)50ul，37°C溫育60分鐘，用PBST洗板3次，拍干，每孔加入50ul TMB(肥0GEN304176)，溫育30分鐘后，每孔加入IN肥S04終止，酶標(biāo)儀450皿讀數(shù)。
[0033] 結(jié)果；特異性99.8%，假陽性0.2%。
[0034] 4. 3靈敏度
[0035] 用風(fēng)疹病毒重組蛋白-HRP復(fù)合物檢測陽性標(biāo)準(zhǔn)品，特異性100%。
[0036] 實(shí)施例5對(duì)比實(shí)驗(yàn)
[0037] 與國外同類產(chǎn)品的比較試驗(yàn)：本發(fā)明試劑盒與國外試劑盒檢測9810份血清樣本 的比較試驗(yàn)結(jié)果如下表：
[00%]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種風(fēng)瘆病毒重組蛋白，其特征在于，所述風(fēng)瘆病毒重組蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1 所示。
2. 權(quán)利要求1所述風(fēng)瘆病毒重組蛋白在制備風(fēng)瘆病毒抗體檢測試劑盒中的應(yīng)用。
3. 編碼SEQ ID NO. 1的風(fēng)瘆病毒重組蛋白基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
4. 一種含有風(fēng)瘆病毒重組蛋白基因的重組載體，其特征在于，在質(zhì)粒pMal-c2x中包含 有SEQ ID NO. 2核苷酸序列。
5. 權(quán)利要求4所述重組載體的蛋白表達(dá)方法，其特征在于，其表達(dá)時(shí)的誘導(dǎo)溫度在37 度，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)速為200rpm，誘導(dǎo)的IPTG濃度為ImM。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種風(fēng)疹病毒重組蛋白，其特征在于，所述風(fēng)疹病毒重組蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明利用基因工程重組技術(shù)，在大腸桿菌系統(tǒng)中表達(dá)風(fēng)疹病毒主要抗原融合蛋白，具有生產(chǎn)周期短，產(chǎn)量高，成本低，特異性好的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的重組蛋白可做為風(fēng)疹病毒免疫診斷試劑盒的一部分。
【IPC分類】C07K19-00, C12N15-62, C12N15-70, G01N33-68
【公開號(hào)】CN104829731
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510103092
【發(fā)明人】阮美麗, 高飛, 陳東
【申請(qǐng)人】杭州奧泰生物技術(shù)有限公司
【公開日】2015年8月12日
【申請(qǐng)日】2015年3月10日