一種大鼠心肌細胞的分離培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于細胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種大鼠心肌細胞的分離培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]在心肌細胞生長發(fā)育、生理、代謝、病理等研宄中具有重要作用。因此，心肌細胞原代培養(yǎng)技術(shù)已廣泛應用于心血管疾病機理及心血管藥物和心臟組織工程學的研宄。目前本領(lǐng)域常見的心肌細胞培養(yǎng)方法有:1.采用乳鼠四肢固定在操作面板上，取心臟這樣的話手術(shù)開口大，出血多，心肌細胞中容易混入大量的血細胞。2.采用10%FCS/DMEM(高糖)培養(yǎng)心肌細胞，此培養(yǎng)基同樣適宜心肌成纖維細胞生長，所以得到的心肌細胞純度低。3.傳統(tǒng)方法培養(yǎng)的心肌細胞達到同步收縮的時間較長，一般至少3天，不能很好的滿足實驗要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]根據(jù)上述所列舉的問題，本發(fā)明提供了一種大鼠心肌細胞的分離培養(yǎng)方法，具有分離培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞存活率高，心肌細胞和非心肌細胞分離較徹底，細胞貼壁快、純度高、節(jié)律性的同步收縮時間早、且操作簡便、重復性好，是一種較為理想的心肌細胞原代培養(yǎng)方法；可以滿足心血管疾病發(fā)生、發(fā)展機理及心血管藥物和心臟組織工程學的研宄及多種生理生化實驗的要求。
[0004]本發(fā)明提供下述技術(shù)方案解決上述技術(shù)問題。
[0005]本發(fā)明提供的技術(shù)方案是:一種大鼠心肌細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于:包括如下步驟:
[0006](I)把新生Sprague-Dawlcy (SD)大鼠(以下簡稱乳鼠)酒精噴拭消毒后置于四周與下層均鋪有紗布的無菌方盒中，以拭干小鼠身上多余的酒精；
[0007](2)左手握住乳鼠，將乳鼠仰臥固定后，碘伏消毒胸腹部并脫典，之后用右手用眼科鑷在上肢間略下處進行用眼科手術(shù)剪“V” 口剪開，左手指手頂鼠脊柱使心臟暴露，心尖即刻蹦出，取另一無菌剪刀剪取心尖部，并將心尖載于有PBS液的培養(yǎng)皿中洗滌，充分去除血細胞；
[0008](3)將心尖組織移入抗生素小瓶中，并加入3ml的DMHM培養(yǎng)基，用眼科剪將大鼠心肌組織剪成IXlmm2的組織塊，吸棄培養(yǎng)基；加入3ml 0.125%的胰蛋白酶，左手握住抗生素瓶瓶壁，以保持37°C胰酶最佳消化溫度；右手拿彎頭吸管吹打lmin，消化液變渾濁后移出消化液并用10% FCS/DMEM中和，未消化組織在抗生素瓶中，重新加入胰酶，如此上方法消化3次并中和；
[0009](4)將細胞懸液過200目篩后，1200rpm/min離心5min，棄上清，細胞沉淀用5%FCS/CMM培養(yǎng)基重懸，細胞懸液接種6孔板I塊，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0010](5)細胞貼壁90min后，吸取未貼壁的心肌細胞懸液，顯微鏡觀察，鏡下可見心肌細胞80-90%融合，并具有較強的自發(fā)節(jié)律性和收縮性特征。
[0011]其中，步驟⑴所述的Sprague-Dawlcy(SD)大鼠是取自新出生1-3天的，并且雌雄不分。
[0012]其中，步驟(2)所述的將心尖載于有PBS液的培養(yǎng)皿中洗滌，洗滌次數(shù)為3次，每次 Imin0
[0013]其中，步驟⑵所述的PBS液已4°C預冷；培養(yǎng)皿置于冰上。
[0014]其中，步驟(5)吸取未貼壁的心肌細胞懸液需要接種6孔板I塊，每孔5X105個/mL細胞，24h更換培養(yǎng)基。
[0015]本發(fā)明所實現(xiàn)的有益效果:本發(fā)明取材方便，大鼠不分雌雄，在培養(yǎng)過程中方法簡單、操作性強，體外心肌細胞分離、培養(yǎng)的方法成本低、耗時短、程序簡化；手術(shù)開口小，出血少，避免大量血細胞污染；使用心肌細胞專用培養(yǎng)基(Cardiac Myocyte Medium,sciencelDCMM，得到大量的純度更高的心肌細胞，從而保證后續(xù)實驗的使用，且分離培養(yǎng)得到的心肌細胞具有自發(fā)節(jié)律性和收縮性特征，能夠保持其在體內(nèi)原有的許多結(jié)構(gòu)和功會K。
【具體實施方式】
[0016]下面通過實施例的方式進一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實施例范圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說明書選擇。本發(fā)明所用試劑和原料均為公知的技術(shù)，在本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員所熟知的技術(shù)，而且在市場上很容易購得。
[0017]本發(fā)明提供了一種大鼠心肌細胞的分離培養(yǎng)方法，具有分離培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞存活率高，心肌細胞和非心肌細胞分離較徹底，細胞貼壁快、純度高、節(jié)律性的同步收縮時間早、且操作簡便、重復性好，是一種較為理想的心肌細胞原代培養(yǎng)方法:可以滿足心血管疾病發(fā)生、發(fā)展機理及心血管藥物和心臟組織工程學的研宄及多種生理生化實驗的要求。
[0018]本發(fā)明提供的技術(shù)方案之一是:一種大鼠心肌細胞的分離培養(yǎng)方法，包括如下步驟:
[0019](I)把新生Sprague-Dawlcy (SD)大鼠(以下簡稱乳鼠)酒精噴拭消毒后置于四周與下層均鋪有紗布的無菌方盒中，以拭干小鼠身上多余的酒精；
[0020](2)左手握住乳鼠，將乳鼠仰臥固定后，碘伏消毒胸腹部并脫典，之后用右手用眼科鑷在上肢間略下處進行用眼科手術(shù)剪“V” 口剪開，左手指手頂鼠脊柱使心臟暴露，心尖即刻蹦出，取另一無菌剪刀剪取心尖部，并將心尖載于有PBS液的培養(yǎng)皿中洗滌，充分去除血細胞；
[0021](3)將心尖組織移入抗生素小瓶中，并加入3ml的DMHM培養(yǎng)基，用眼科剪將大鼠心肌組織剪成IXlmm2的組織塊，吸棄培養(yǎng)基；加入3ml 0.125%的胰蛋白酶，左手握住抗生素瓶瓶壁，以保持37°C胰酶最佳消化溫度；右手拿彎頭吸管吹打lmin，消化液變渾濁后移出消化液并用10% FCS/DMEM中和，未消化組織在抗生素瓶中，重新加入胰酶，如此上方法消化3次并中和；
[0022](4)將細胞懸液過200目篩后，1200rpm/min離心5min，棄上清，細胞沉淀用5%FCS/CMM培養(yǎng)基重懸，細胞懸液接種6孔板I塊，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0023](5)細胞貼壁90min后，吸取未貼壁的心肌細胞懸液，顯微鏡觀察，鏡下可見心肌細胞80-90%融合，并具有較強的自發(fā)節(jié)律性和收縮性特征。
[0024]其中，步驟⑴所述的Sprague-Dawlcy(SD)大鼠是取自新出生1-3天的，并且雌雄不分。
[0025]其中，步驟(2)所述的將心尖載于有PBS液的培養(yǎng)皿中洗滌，洗滌次數(shù)為3次，每次 Imin0
[0026]其中，步驟⑵所述的PBS液已4°C預冷；培養(yǎng)皿置于冰上。
[0027]其中，步驟(5)吸取未貼壁的心肌細胞懸液需要接種6孔板I ±夬，每孔5X105個/mL細胞，24h更換培養(yǎng)基。
[0028]本發(fā)明所實現(xiàn)的有益效果:本發(fā)明取材方便，大鼠不分雌雄，在培養(yǎng)過程中方法簡單、操作性強，體外心肌細胞分離、培養(yǎng)的方法成本低、耗時短、程序簡化；手術(shù)開口小，出血少，避免大量血細胞污染；使用心肌細胞專用培養(yǎng)基(Cardiac Myocyte Medium,sciencelDCMM，得到大量的純度更高的心肌細胞，從而保證后續(xù)實驗的使用，且分離培養(yǎng)得到的心肌細胞具有自發(fā)節(jié)律性和收縮性特征，能夠保持其在體內(nèi)原有的許多結(jié)構(gòu)和功會K。
[0029]以上所記載，僅為利用本創(chuàng)作技術(shù)內(nèi)容的實施例，任何熟悉本項技藝者運用本創(chuàng)作所做的修飾、變化，皆屬本創(chuàng)作主張的專利范圍，而不限于實施例所揭示者。
【主權(quán)項】
1.一種大鼠心肌細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于:包括如下步驟: (1)把新生Sprague-Dawlcy(SD)大鼠(以下簡稱乳鼠)酒精噴拭消毒后置于四周與下層均鋪有紗布的無菌方盒中，以拭干小鼠身上多余的酒精； (2)左手握住乳鼠，將乳鼠仰臥固定后，碘伏消毒胸腹部并脫典，之后用右手用眼科鑷在上肢間略下處進行用眼科手術(shù)剪“V” 口剪開，左手指手頂鼠脊柱使心臟暴露，心尖即刻蹦出，取另一無菌剪刀剪取心尖部，并將心尖載于有PBS液的培養(yǎng)皿中洗滌，充分去除血細胞； (3)將心尖組織移入抗生素小瓶中，并加入3ml的DMEM培養(yǎng)基，用眼科剪將乳鼠心肌組織剪成IXlmm2的組織塊，吸棄培養(yǎng)基；加入3ml 0.125%的胰蛋白酶，左手握住抗生素瓶瓶壁，以保持37°C胰酶最佳消化溫度；右手拿彎頭吸管吹打lmin，消化液變渾濁后移出消化液并用10% FCS/DMEM中和，未消化組織在抗生素瓶中，重新加入胰酶，如此上方法消化3次并中和； (4)將細胞懸液過200目篩后，1200rpm/min離心5min，棄上清，細胞沉淀用5%FCS/CMM培養(yǎng)基重懸，細胞懸液接種6孔板I塊，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； (5)細胞貼壁90min后，吸取未貼壁的心肌細胞懸液，顯微鏡觀察，鏡下可見心肌細胞80-90%融合，并具有較強的自發(fā)節(jié)律性和收縮性特征。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種大鼠心肌細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟(I)所述的Sprague-Dawlcy(SD)大鼠是取自新出生1-3天的，并且雌雄不分。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種大鼠心肌細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟(2)所述的將心尖載于有PBS液的培養(yǎng)皿中洗滌，洗滌次數(shù)為3次，每次lmin。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的一種大鼠心肌細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟(2)所述的PBS液已4°C預冷；培養(yǎng)皿置于冰上。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種大鼠心肌細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟(5)吸取未貼壁的心肌細胞懸液需要接種6孔板I塊，每孔5X105個/mL細胞，24h更換培養(yǎng)基。
【專利摘要】本發(fā)明公開一種大鼠心肌細胞的分離培養(yǎng)方法，采用本方法分離培養(yǎng)的心肌細胞存活率高，心肌細胞和非心肌細胞分離較徹底，細胞貼壁快、純度高，節(jié)律性的同步收縮時間早，且操作簡便、重復性好，是一種較為理想的心肌細胞原代培養(yǎng)方法?？梢詽M足心血管疾病發(fā)生、發(fā)展機理及心血管藥物和心臟組織工程學的研究及多種生理生化實驗的要求。
【IPC分類】C12N5-077
【公開號】CN104830759
【申請?zhí)枴緾N201510221469
【發(fā)明人】蔡維霞, 胡大海, 朱雄翔, 韓軍濤, 鄭朝, 官浩, 楊薛康, 王耘川, 計鵬
【申請人】中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學
【公開日】2015年8月12日
【申請日】2015年5月5日