一種采用全細(xì)胞轉(zhuǎn)化高效生產(chǎn)α-苯丙酮酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種采用全細(xì)胞轉(zhuǎn)化高效生產(chǎn)a-苯丙酮酸的方法，屬于發(fā)酵工程領(lǐng) 域。
【背景技術(shù)】
[0002] a_苯丙酮酸（PPA)有很多應(yīng)用，可用來合成抗腫瘤藥物的雜環(huán)化合物，可作為抗 氧化劑及促進(jìn)傷口愈合。是合成D-苯丙氨酸的原材料，D-苯丙氨酸是手性藥物中間體。 PPA還可用于制備苯乳酸，苯乳酸可作為抗菌物質(zhì)。傳統(tǒng)PPA生產(chǎn)采用化學(xué)法，化學(xué)法的主 要缺點(diǎn)是缺乏選擇性，采用有毒的氰化物及金屬銅，產(chǎn)率低，且污染環(huán)境。酶和全細(xì)胞生物 催化劑越來越多的用于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0003] L-氨基酸脫氨酶（EC1. 4. 3. 2)催化L-氨基酸氧化脫氨基，生成相應(yīng)a-酮酸和 氨，多為黃素蛋白，二聚體結(jié)構(gòu)。Proteus mirabilis KCTC2566有兩種L-氨基酸脫氨酶，一 種具有廣泛的底物特異性，能夠催化脂肪族和芳香族L-氨基酸，尤其對(duì)L-苯丙氨酸具有較 高催化活性；另一種具有底物限制性，只對(duì)堿性氨基酸具有催化活性，尤其是L-組氨酸。
[0004] 全細(xì)胞轉(zhuǎn)化相比分離酶具有許多優(yōu)勢(shì)：易制備，成本低；更穩(wěn)定，使用方便；無污 染，副產(chǎn)物少。之前的研宄中我們已經(jīng)成功構(gòu)建了大腸桿菌全細(xì)胞催化劑，并對(duì)大腸桿菌進(jìn) 行改造，敲除了降解PPA的三種氨基酸脫氨酶，轉(zhuǎn)化率39 %。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的第一個(gè)技術(shù)問題是提供一種L-氨基酸脫氨酶突變體，是以核苷 酸序列如SEQIDNO. 1所示的基因編碼的酶作為親本改造得到，所述L-氨基酸脫氨酶突變 體是D165G/S179L/F263V/L336V或D165K/F263M/L336M或D165K或F263M或L336M。
[0006] 所述突變體可以通過易錯(cuò)PCR和/或定點(diǎn)突變獲得。
[0007] 本發(fā)明要解決的第二個(gè)技術(shù)問題是提供含有所述L-氨基酸脫氨酶突變體的全細(xì) 胞催化劑，是將編碼所述L-氨基酸脫氨酶突變體的基因轉(zhuǎn)化大腸桿菌得到重組菌，所得重 組菌可用于高效轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸生產(chǎn)PPA。
[0008] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述大腸桿菌是E.coliBL21(DE3)。
[0009] 本發(fā)明要解決的第三個(gè)技術(shù)問題是提供應(yīng)用所述全細(xì)胞催化劑轉(zhuǎn)化生產(chǎn) a-苯丙酮酸的方法，將L-苯丙氨酸10-12g/L、全細(xì)胞催化劑1. 2-1. 5g/L，在20mM Tris-HCl(pH8. 0)中，于 36-37°C、200-220rpm轉(zhuǎn)化 6h。
[0010] 所述全細(xì)胞催化劑是濕菌體。
[0011] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述全細(xì)胞催化劑的獲得，是將含有L-氨基酸脫氨 酶突變體的重組大腸桿菌按1-2%接種量接到1.8L發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌轉(zhuǎn)速、通氣量和溫 度分別為400rpm、1 ?Ovvm和28°C，當(dāng)0D6QQ達(dá)到0? 6-0. 8，加入0? 4mMIPTG誘導(dǎo)L-氨基酸脫 氨酶表達(dá)。誘導(dǎo)5_7h后，8,OOOrpm低溫離心10_15min，收集菌體，用20mMTris-HCl(pH8. 0) 緩沖液洗兩遍菌體即得。
[0012] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL。 各組分溶解后高壓滅菌。冷卻到60°C，再加100mL滅菌的17mmol/LKH2P〇dP72mmol/L K2HP04的溶液（2. 31g的KH孑04和12. 54g的K，04溶于水中，終體積為100mL，高壓滅菌）。
[0013] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，全細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系為：L-苯丙氨酸10g/L，全細(xì)胞催化 劑1. 2g/L，反應(yīng)在20mMTris-HCl (pH8.0)中進(jìn)行，37°C，200rpm轉(zhuǎn)化6h。
[0014] 本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明成功實(shí)現(xiàn)了L-氨基酸脫氨酶的改造，提高了利用大腸 桿菌重組細(xì)胞轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸生產(chǎn)PPA的轉(zhuǎn)化率。含有L-氨基酸脫氨酶突變體D165G/ S179L/F263V/L336V的重組菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸生產(chǎn)PPA的轉(zhuǎn)化率為81 %。含有L-氨 基酸脫氨酶突變體D165K/F263M/L336M的重組菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸生產(chǎn)PPA的轉(zhuǎn)化 率為100%。本發(fā)明建立的全細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系，解決了化學(xué)法合成PPA的步驟繁瑣、得率低、污 染環(huán)境等問題及酶法轉(zhuǎn)化生產(chǎn)PPA的轉(zhuǎn)化率低的問題，實(shí)現(xiàn)了無污染、高產(chǎn)率、一步法生產(chǎn) PPA，為后續(xù)工業(yè)化生產(chǎn)奠定了一定的理論基礎(chǔ)。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 材料與方法
[0016] 種子培養(yǎng)基：蛋白胨lg，酵母粉0.5g，NaCllg，自來水定容至100mL。
[0017] 發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL。各組分溶解后高壓滅菌。冷 卻到 60°C，再加 100mL滅菌的 17mmol/LKH2P04和 72mmol/LK2HP04的溶液。
[0018]PPA含量測(cè)定：將轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行離心，取上清100yL，加入3mL三氯化鐵，分光光度 計(jì)測(cè)定640nm的吸光度。
[0019] 實(shí)施例1易錯(cuò)PCR對(duì)L-氨基酸脫氨酶進(jìn)行改造
[0020] 以P.mirabilisKCTC2566的基因組為模板，克隆得到編碼L-氨基酸脫氨酶的基因 pma，連接載體pET_20b(+)，以所得重組質(zhì)粒pET-pma為模板，MutazymeIIDNApolymerase 低保真酶擴(kuò)增pma基因。PCR產(chǎn)物純化、酶切后，與載體pET-20b(+)連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn) 化大腸桿菌BL21構(gòu)建突變體文庫。挑取氨芐抗性平板上生長的單菌落接種到LB，在96孔 板中37°C震蕩過夜培養(yǎng)，接種到另一塊96孔板的TB培養(yǎng)基中，IPTG誘導(dǎo)5h，測(cè)定PPA產(chǎn) 量。初篩后，PPA產(chǎn)量高的菌株搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，進(jìn)一步測(cè)試底物轉(zhuǎn)化率，（底物轉(zhuǎn)化率=轉(zhuǎn)化 為PPA的底物濃度/初始底物濃度*100% )。轉(zhuǎn)化率高的菌株，提取質(zhì)粒，作為下一輪易錯(cuò) PCR或定點(diǎn)飽和突變的模板。
[0021] 實(shí)施例2定點(diǎn)突變對(duì)L-氨基酸脫氨酶進(jìn)行改造
[0022] 對(duì)實(shí)施例1得到的轉(zhuǎn)化率高的突變體的突變位點(diǎn)逐個(gè)進(jìn)行定點(diǎn)飽和突變。以實(shí)施 例1突變后的重組質(zhì)粒為模板，Prime-STARHSDNApolymerase高保真酶及設(shè)計(jì)的突變引 物一步法擴(kuò)增，Dpnl限制性內(nèi)切酶消化模板DNA，然后磷酸化，連接為全質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿 菌BL21。
[0023] 兩輪改造后，得到的單突變體中，PPA產(chǎn)量較高的突變體為：D165K，F(xiàn)263M，L336M。 將這幾個(gè)突變位點(diǎn)組合在一起，構(gòu)建復(fù)合突變體D165K/F263M/L336M。含野生型L-氨基酸 脫氨酶及各突變體的重組菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化PPA的轉(zhuǎn)化率如表1所示。
[0024]表1
[0025]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種L-氨基酸脫氨酶突變體，其特征在于，是以核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示 的基因編碼的酶作為親本改造得到，所述L-氨基酸脫氨酶突變體是D165G/S179L/F263V/ L336V 或 D165K/F263M/L336M 或 D165K 或 F263M 或 L336M。
2. 編碼權(quán)利要求1所述突變體的基因。
3. 權(quán)利要求1所述L-氨基酸脫氨酶突變體在生產(chǎn)α -苯丙酮酸中的應(yīng)用。
4. 含有權(quán)利要求1所述L-氨基酸脫氨酶突變體的全細(xì)胞催化劑，其特征在于，是將編 碼所述L-氨基酸脫氨酶突變體的基因轉(zhuǎn)化大腸桿菌得到重組菌，將重組菌作為全細(xì)胞催 化劑。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的全細(xì)胞催化劑，其特征在于，所述大腸桿菌是Ε. coli BL21(DE3) 〇
6. 應(yīng)用權(quán)利要求4或5所述全細(xì)胞催化劑轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸生產(chǎn)α -苯丙酮酸的方 法，其特征在于，將L-苯丙氨酸10-12g/L、全細(xì)胞催化劑I. 2-1. 5g/L，在pH 8. O的20mM Tris-HCl 中，于 36-37 °C、200-220rpm 轉(zhuǎn)化 6h。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述全細(xì)胞催化劑是濕菌體。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述全細(xì)胞催化劑的獲得，是將含有L-氨 基酸脫氨酶突變體的重組大腸桿菌按1-2%接種量接到1.8L發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌轉(zhuǎn)速、 通氣量和溫度分別為400rpm、l. Ovvm和28°C，當(dāng)OD6tltl達(dá)到0. 6-0. 8,加入0. 4mM IPTG誘 導(dǎo)L-氨基酸脫氨酶表達(dá)；誘導(dǎo)5-7h后，8, OOOrpm低溫離心l〇-15min，收集菌體，用20mM Tris-HCKpH 8.0)緩沖液洗兩遍菌體即得。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨12g，酵母提取物 24g，甘油4mL，各組分溶解后高壓滅菌，冷卻到60°C，再加 IOOmL滅菌的17mmol/L ΚΗ2Ρ0# 72mmol/L 1(2即04的溶液。
10. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，全細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系為：L-苯丙氨酸10g/L， 全細(xì)胞催化劑I. 2g/L，反應(yīng)在pH 8. 0的20mM Tris-HCl中進(jìn)行，37°C，200rpm轉(zhuǎn)化6h。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種采用全細(xì)胞轉(zhuǎn)化高效生產(chǎn)α-苯丙酮酸的方法，屬于發(fā)酵工程領(lǐng)域。本發(fā)明對(duì)L-氨基酸脫氨酶進(jìn)行了改造，獲得活性提高的L-氨基酸脫氨酶突變體。以含有L-氨基酸脫氨酶突變體的重組菌全組細(xì)胞轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸生產(chǎn)PPA，L-苯丙氨酸生產(chǎn)PPA的轉(zhuǎn)化率顯著提高。本發(fā)明建立的全細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系，解決了化學(xué)法合成PPA的步驟繁瑣、得率低、污染環(huán)境等問題及酶法轉(zhuǎn)化生產(chǎn)PPA的轉(zhuǎn)化率低的問題，實(shí)現(xiàn)了無污染、高產(chǎn)率、一步法生產(chǎn)PPA，為后續(xù)工業(yè)化生產(chǎn)奠定了一定的理論基礎(chǔ)。
【IPC分類】C12N9-06, C12P7-40, C12R1-19, C12N1-21, C12N15-53
【公開號(hào)】CN104830815
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510295252
【發(fā)明人】陳堅(jiān), 劉龍, 李江華, 堵國成, 侯穎, 顧漢章, 徐堃
【申請(qǐng)人】江南大學(xué), 江蘇漢光生物工程有限公司
【公開日】2015年8月12日
【申請(qǐng)日】2015年6月2日