一種硅珠法結(jié)合離心套管提取dna的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種提取DNA的方法，具體是對(duì)現(xiàn)有硅珠法的改進(jìn)，采用硅珠法結(jié)合離心套管提取DNA的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]硅珠法是在高濃度的硫氰酸胍存在的條件下，DNA能夠被二氧化硅特異性地吸附；當(dāng)條件消失后，DNA又可以從二氧化硅上解離出來(lái)。采用的細(xì)胞破碎條件比較激烈和充分硫氰酸胍是高性能的蛋白變性劑，可以使蛋白質(zhì)與DNA充分分離，在硅珠吸附前，高速離心，可以將不溶性物質(zhì)去除，吸附后漂洗將溶解性PCR抑制劑除去。概括地說(shuō)，即利用二氧化硅微粒特異捕獲有機(jī)質(zhì)溶液中DNA分子的性能提取DNA的方法。
[0003]如中華人民共和國(guó)公共安全行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)GA/T383-2002，法庭科學(xué)DNA實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)范中公開(kāi)了硅珠法的提取步驟:
[0004]a)在檢材中加入TES緩沖液和十二烷基肌氨酸鈉，煮沸5min以上，離心去載體；
[0005]b)加入吸附液混合后加入娃珠懸液，混合后置于室溫15min左右；
[0006]c)離心去上清液，加入漂洗液，混合；
[0007]d)離心去上清，加入冷70%乙醇，混合；
[0008]e)離心去上清液，加入TES，56°C保溫1min以上；
[0009]f)離心后4°C冰箱內(nèi)備用。
[0010]以上這種方法在行業(yè)內(nèi)廣泛使用，其優(yōu)點(diǎn)是提取后的DNA模板純度高，基本無(wú)雜質(zhì)殘留，有利于PCR擴(kuò)增，對(duì)于血跡、煙頭等雜質(zhì)含量高、模板濃度高的常規(guī)檢材，提取效果好。但這種方法在微量檢材檢驗(yàn)時(shí)效果差，DNA面板損失量較大，損失率高達(dá)80-90%，檢出率低下。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明的目的是提供一種硅珠法結(jié)合離心套管提取DNA的方法，該提取方法適用于微量檢材的檢驗(yàn)。
[0012]為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是:
[0013]一種硅珠法結(jié)合離心套管提取DNA的方法，包括以下步驟:
[0014](I)將檢材置入離心套管的內(nèi)套管內(nèi)，將TES緩沖液、十二烷基肌氨酸鈉、蛋白酶K(10mg/ml)按體積比10:2?3:2?3(優(yōu)選體積比10:2:2)混勻后，取160?200微升，加入離心套管的內(nèi)套管內(nèi)，置37?56°C (優(yōu)選56°C)金屬浴上裂解20?30分鐘，95?990C (優(yōu)選"°C )裂解10?I5分鐘。
[0015]在本專利中，離心套管采用專利文獻(xiàn)CN103146569B公開(kāi)的離心管，該離心管包括離心管和內(nèi)套管。
[0016]本步驟的目的是將DNA裂解，將DNA與蛋白質(zhì)分離，從細(xì)胞核中釋放出來(lái)。
[0017](2)將離心套管放入離心機(jī)中13000?17000g (優(yōu)選15000g)離心0.5?I分鐘，打開(kāi)離心套管的管蓋加入吸附液200?300微升，再次放入離心機(jī)13000?17000g離心2?5分鐘。本步驟是利用具有過(guò)濾作用的離心套管去除載體和雜質(zhì)。
[0018](3)打開(kāi)離心套管管蓋，去除內(nèi)套管，加入吸附液700?1000微升，加入硅珠懸濁液10?16微升，靜置吸附15?20分鐘。本步驟的目的是將水溶性DNA吸附在硅珠上。
[0019]上述吸附液優(yōu)選硫氰酸胍。
[0020](4)去除吸附液:將離心套管的離心管置于離心機(jī)內(nèi)6000?8000g離心20?30
秒，去除上清。
[0021](5)充分去除吸附液:再次將離心套管的離心管置入離心機(jī)內(nèi)6000?8000g離心，離心時(shí)間優(yōu)選30秒，吸去殘液。
[0022](6)加入600?800微升70%冰乙醇，充分渦旋后，將離心套管的離心管置于離心機(jī)內(nèi)6000?8000g離心20?30秒，去除上清。本步驟的目的是洗去殘留擴(kuò)增抑制物，如殘留吸附液。
[0023](7)再次將離心套管的離心管置入離心機(jī)內(nèi)6000?8000g離心，離心時(shí)間優(yōu)選30
秒，吸去殘液。
[0024](8)置56°C金屬浴上開(kāi)蓋烘干硅珠，充分去除殘留乙醇，加入洗脫液20?100微升，充分渦旋后，置56?60°C金屬浴上孵化15?20分鐘，將DNA從硅珠上釋放出來(lái)。
[0025](9)將硅珠懸濁液加入PCR擴(kuò)增液內(nèi)擴(kuò)增，提高DNA模板產(chǎn)量。
[0026]本發(fā)明利用機(jī)械離心原理，使用離心套管將載體上的DNA充分移至離心管內(nèi)，并最大限度地過(guò)濾雜質(zhì)，保留DNA模板；加大吸附液的用量，(現(xiàn)有技術(shù)用量為300微升，本發(fā)明中用量在1200微升左右)，從而保證吸附液的濃度沒(méi)有明顯下降，從而保證硅珠能夠充分吸附DNA ;刪去現(xiàn)有技術(shù)中的漂洗步驟，不僅簡(jiǎn)化提取流程，更重要的是減少DNA模板損失；減少乙醇漂洗步驟，在充分吸取殘留物的基礎(chǔ)上，減少DNA模板損失；將硅珠懸濁液加入PCR擴(kuò)增液內(nèi)擴(kuò)增，使硅珠上的殘留的DNA模板得到充分利用。
[0027]本發(fā)明方法檢出率高，最終模板保有量達(dá)50-70%，特別適用于微量檢材的檢驗(yàn)，可檢出模板含量在10pg以上的現(xiàn)場(chǎng)DNA檢材。
【具體實(shí)施方式】
[0028]實(shí)施例1
[0029](I)將手套印棉簽拭子置入離心套管的內(nèi)套管內(nèi)，將TES緩沖液、十二烷基肌氨酸鈉、蛋白酶K (10mg/ml)按體積比10:2:2混勻后，取200微升，加入離心套管的內(nèi)套管內(nèi)，置56 °C金屬浴上裂解20分鐘，95 °C裂解10分鐘；
[0030](2)將離心套管放入離心機(jī)中17000g離心30秒，打開(kāi)離心套管的管蓋加入吸附液200微升，再次放入離心機(jī)15000g離心2分鐘；
[0031](3)打開(kāi)離心套管的管蓋，去除內(nèi)套管，加入硫氰酸胍1000微升，加入硅珠懸濁液10微升，置自動(dòng)渦旋儀上1300轉(zhuǎn)吸附15分鐘；
[0032](4)將離心套管的離心管置于離心機(jī)內(nèi)8000g離心30秒，去除上清；
[0033](5)再次將離心套管的離心管置入離心機(jī)內(nèi)8000g離心30秒，吸去殘夜；
[0034](6)加入750微升70%冰乙醇，充分渦旋后，將離心套管的離心管置于離心機(jī)內(nèi)8000g離心20秒，去除上清；
[0035](7)再次將離心套管的離心管置入離心機(jī)內(nèi)，8000g離心30秒，吸去殘液；
[0036](8)置56°C金屬浴上開(kāi)蓋烘干娃珠，加入洗脫液20微升，充分禍旋后，置56°C金屬浴上孵化15分鐘；
[0037](9)將硅珠懸濁液加入PCR擴(kuò)增液內(nèi)擴(kuò)增。
[0038]提取結(jié)果:檢出1?板含星在10pg的手套印棉簽拭子。
[0039]實(shí)施例2
[0040](I)將網(wǎng)線插頭壓片剪入離心套管的內(nèi)套管內(nèi)，將TES緩沖液、十二烷基肌氨酸鈉、蛋白酶K (10mg/ml)按體積比10:2:3混勻后，取160微升，加入離心套管的內(nèi)套管內(nèi)，置56°C金屬浴上裂解20分鐘，99°C裂解15分鐘；
[0041](2)將離心套管放入離心機(jī)中15000g離心I分鐘，打開(kāi)離心套管的管蓋加入吸附液200微升，再次放入尚心機(jī)13000g尚心5分鐘；
[0042](3)打開(kāi)離心套管的管蓋，去除內(nèi)套管，加入硫氰酸胍700微升，加入硅珠懸濁液16微升，置自動(dòng)渦旋儀上1000轉(zhuǎn)吸附20分鐘；
[0043](4)將離心套管的離心管置于離心機(jī)內(nèi)6000g離心30秒，去除上清；
[0044](5)再次將離心套管的離心管置入離心機(jī)內(nèi)，6000g離心30秒，吸去殘夜；
[0045](6)加入600微升70%冰乙醇，充分渦旋后，將離心套管的離心管置于離心機(jī)內(nèi)6000g離心30秒，去除上清；
[0046](7)再次將離心套管的離心管置入離心機(jī)內(nèi)，6000g離心30秒，吸去殘液；
[0047](8)置56°C金屬浴上開(kāi)蓋烘干娃珠，加入洗脫液80微升，充分禍旋后，置60°C金屬浴上孵化15分鐘；
[0048](9)將硅珠懸濁液加入PCR擴(kuò)增液內(nèi)擴(kuò)增。
[0049]提取結(jié)果:檢出模板含量在lOOpg，檢出率在80%以上。
[0050]實(shí)施例3
[0051](I)將作案工具手柄擦拭子置入離心套管的內(nèi)套管內(nèi)，將TES緩沖液、十二烷基肌氨酸鈉、蛋白酶K(10mg/ml)按體積比10:3:3混勻后，取180微升，加入離心套管的內(nèi)套管內(nèi)，置37°C金屬浴上裂解30分鐘，99°C裂解10分鐘；
[0052](2)將離心套管放入離心機(jī)中13000g離心I分鐘，打開(kāi)離心套管的管蓋加入吸附液300微升，再次放入離心機(jī)17000g離心2分鐘；
[0053](3)打開(kāi)離心套管的管蓋，去除內(nèi)套管，加入硫氰酸胍1000微升，加入硅珠懸濁液16微升，置自動(dòng)渦旋儀上1200轉(zhuǎn)吸附18分鐘；
[0054](4)將離心套管的離心管置于離心機(jī)內(nèi)8000g離心20秒，去除上清；
[0055](5)再次將離心套管的離心管置入離心機(jī)內(nèi)，8000g離心30秒，吸去殘夜；
[0056](6)加入800微升70%冰乙醇，充分渦旋后，將離心套管的離心管置于離心機(jī)內(nèi)8000g離心20秒，去除上清；
[0057](7)再次將離心套管的離心管置入離心機(jī)內(nèi)，8000g離心30秒，吸去殘液；
[0058](8)置56°C金屬浴上開(kāi)蓋烘干娃珠，加入洗脫液100微升，充分禍旋后，置56°C金屬浴上孵化20分鐘；
[0059](9)將硅珠懸濁液加入PCR擴(kuò)增液內(nèi)擴(kuò)增。
[0060]提取結(jié)果:檢出模板含量在lOOpg，檢出率在80%以上。
[0061]上述實(shí)施例不以任何方式限制本發(fā)明，凡是采用等同替換或等效變換的方式獲得的技術(shù)方案均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種硅珠法結(jié)合離心套管提取DNA的方法，其特征在于包括以下步驟: (1)將檢材置入離心套管的內(nèi)套管內(nèi)，將TES緩沖液、十二烷基肌氨酸鈉、蛋白酶K(10mg/ml)按體積比10:2?3:2?3混勾后，取160?200微升，加入離心套管的內(nèi)套管內(nèi)，置37?56°C金屬浴上裂解20?30分鐘，95?99°C裂解10?15分鐘； (2)將離心套管放入離心機(jī)中13000?17000g離心0.5?I分鐘，打開(kāi)離心套管的管蓋加入吸附液200?300微升，再次放入離心機(jī)13000?17000g離心2?5分鐘； (3)打開(kāi)離心套管管蓋，去除內(nèi)套管，加入吸附液700?1000微升，加入硅珠懸濁液10?16微升，靜置吸附15?20分鐘； (4)將離心套管的離心管置于離心機(jī)內(nèi)6000?8000g離心20?30秒，去除上清； (5)再次將離心套管的離心管置入離心機(jī)內(nèi)6000?8000g離心，吸去殘液； (6)加入600?800微升70%冰乙醇，充分渦旋后，將離心套管的離心管置于離心機(jī)內(nèi)6000?8000g離心20?30秒，去除上清； (7)再次將離心套管的離心管置入離心機(jī)內(nèi)，6000?8000g離心，吸去殘液； (8)置56°C金屬浴上開(kāi)蓋烘干娃珠，加入洗脫液20?100微升，充分禍旋后，置56?60°C金屬浴上孵化15?20分鐘； (9)將硅珠懸濁液加入PCR擴(kuò)增液內(nèi)擴(kuò)增。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種硅珠法結(jié)合離心套管提取DNA的方法，其特征在于:在所述步驟(I)中，所述體積比10:2:2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種硅珠法結(jié)合離心套管提取DNA的方法，其特征在于:在所述步驟(I)中，置56°C金屬浴上裂解20?30分鐘，99°C裂解10?15分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種硅珠法結(jié)合離心套管提取DNA的方法，其特征在于:在所述步驟(2)中，離心套管放入離心機(jī)中15000g離心。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種硅珠法結(jié)合離心套管提取DNA的方法，其特征在于:所述吸附液為硫氰酸胍。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種硅珠法結(jié)合離心套管提取DNA的方法，其特征在于:在所述步驟(5)和(7)中，離心機(jī)離心時(shí)間為30秒。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種硅珠法結(jié)合離心套管提取DNA的方法，包括以下步驟：1)將檢材置入離心套管的內(nèi)套管內(nèi)，將TES緩沖液、十二烷基肌氨酸鈉、蛋白酶K混勻加入內(nèi)套管內(nèi)，置金屬浴上裂解；2)離心機(jī)中離心，加入吸附液再次離心；3)去除內(nèi)套管加入吸附液、硅珠懸濁液靜置吸附；4)離心去除上清；5)離心吸去殘液；6)加入冰乙醇離心去除上清；7)離心吸去殘液；8)烘干硅珠，加入洗脫液孵化；9)加入PCR擴(kuò)增液內(nèi)擴(kuò)增；本發(fā)明方法檢出率高，最終模板保有量達(dá)50-70％，特別適用于微量檢材的檢驗(yàn)，可檢出模板含量在100pg以上的現(xiàn)場(chǎng)DNA檢材。
【IPC分類】C12N15-10
【公開(kāi)號(hào)】CN104830834
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510233054
【發(fā)明人】齊潔麗
【申請(qǐng)人】上?；菸纳锛夹g(shù)有限公司
【公開(kāi)日】2015年8月12日
【申請(qǐng)日】2015年5月8日