一種利用嗜熱乳桿菌從l-谷氨酸生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)l-谷氨酰胺的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種利用嗜熱乳桿菌從L-谷氨酸生 物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)L-谷氨酰胺的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] L-谷氨酰胺占人體游離氨基酸的61%，是人體最普遍的、不可缺乏的條件性必需 氨基酸。
[0003] 近二十年前，科學(xué)家們只知道L-谷氨酰胺的存在但并不是十分了解它的作用。一 般將其視為治療消化道潰瘍藥物之一。但是十多年來(lái)這種情況有了巨大的改變。由于一系 列的突破性發(fā)現(xiàn)，科學(xué)家們認(rèn)為L(zhǎng)-谷氨酰胺是"不可缺乏的非必需氨基酸"，它已經(jīng)成為發(fā) 展新型藥物、臨床治療及運(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)保健的重要材料。
[0004]目前，生產(chǎn)L-谷氨酰胺的方法有發(fā)酵法、酶法和化學(xué)合成法?；瘜W(xué)合成法生產(chǎn)過(guò) 程中要用易燃易爆的二硫化碳，工人工作條件難以令人滿意，產(chǎn)品帶有或輕或重的醋酸硫 化物臭味；酶法需要制備谷氨酰胺合成酶，制備費(fèi)用高，技術(shù)難度大；發(fā)酵法是現(xiàn)在較通用 的L-谷氨酰胺生產(chǎn)方法，現(xiàn)有技術(shù)中主要是采用以葡萄糖為底物，黃色短桿菌為菌種直接 發(fā)酵法生產(chǎn)L-谷氨酰胺，該方法原材料便宜易得，產(chǎn)品質(zhì)量可靠穩(wěn)定，但是，存在著生產(chǎn)周 期長(zhǎng)，效率低，產(chǎn)品收率低，產(chǎn)品不易分離提取等缺陷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種有效提高L-谷氨酰胺的 生產(chǎn)效率，降低L-谷氨酰胺的生產(chǎn)成本，縮短生產(chǎn)周期，發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)物積累濃度高，產(chǎn)物易 分離提取的利用嗜熱乳桿菌從L-谷氨酸生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)L-谷氨酰胺的方法。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的所采取的技術(shù)方案為：
[0007] -種利用嗜熱乳桿菌從L-谷氨酸生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)L-谷氨酰胺的方法，其特征在 該方法是以L-谷氨酸為反應(yīng)底物，以嗜熱乳桿菌全細(xì)胞為生化反應(yīng)的酶進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化生 產(chǎn)L-谷氨酰胺。
[0008] 上述嗜熱乳桿菌全細(xì)胞的制備方法為：首先將斜面保存的嗜熱乳桿菌進(jìn)行搖瓶種 子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)，然后離心分離，菌體破碎得到。
[0009] 上述搖瓶種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基組成為：酪朊水解物l〇g/L，酵 母膏5g/L，牛肉膏5g/L，葡萄糖20g/L，檸檬酸二銨2g/L，吐溫801. OmL/L，KH2P046g/ L, MgS04?7H20 0? 58g/L，MnS04?4H20 0? 15g/L，F(xiàn)eS04?7H200. 03g/L，L-谷氨酸鈉25g/ L〇
[0010] 上述發(fā)酵培養(yǎng)條件為：發(fā)酵液接種量為5%~15%，pH值為5. 5~6. 5,培養(yǎng)溫度 為40°C~45°C，通風(fēng)量為0. 2~1. 5vvm，攪拌轉(zhuǎn)速為100~200r/min，發(fā)酵時(shí)間為15~ 24h〇
[0011] 上述離心分離是指在4000~6000r/min，4~6°C下離心10~15分鐘。
[0012] 上述菌體破碎采用超聲波破碎，超聲波工作頻率20~25KHz，功率為500W~ 800W，間歇時(shí)間為30s~35s，破碎時(shí)間為10~15min。
[0013] 所述生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)過(guò)程為：首先配制質(zhì)量百分比濃度為15%~20%的L-谷氨酸 的水溶液，然后加入其質(zhì)量的30 %~40 %的硫酸銨，用堿調(diào)整pH值為5. 8~6. 0,最后加入 L-谷氨酸質(zhì)量的10%~15%的嗜熱乳桿菌全細(xì)胞，在溫度45°C~50°C，攪拌轉(zhuǎn)速200~ 300r/min的轉(zhuǎn)化條件下進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化。
[0014] 在生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中流加氨水。
[0015] 在生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)開始5h后，根據(jù)pH值的變化情況流加一定量的氨水，使反應(yīng)體系 的pH值保持在5. 8~6. 0。
[0016] 在生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中，當(dāng)轉(zhuǎn)化體系連續(xù)3小時(shí)pH值的變化小于0. 1時(shí)，反應(yīng)終止。
[0017] 本發(fā)明的設(shè)計(jì)原理為：
[0018] 通常來(lái)說(shuō)，L-谷氨酰胺的生物合成途徑是首先由葡萄糖生物合成谷氨酸，再由谷 氨酸生物合成L-谷氨酰胺，其中由L-谷氨酸生物合成L-谷氨酰胺有兩個(gè)步驟：
[0019] 1.谷氨酸（GA)在谷氨酸激酶（glutamatekinase)和ATP參與下生成y-谷氨酰 磷酸；
[0020] 2.y-谷氨酰磷酸和NH4+在谷氨酰胺合成酶（GM合成酶）和Mg2+參與下進(jìn)一步 生成谷氨酰胺。
[0021] 從上面可以看出，谷氨酸激酶是谷氨酰胺生物合成中的關(guān)鍵酶，因?yàn)樗呋斯?氨酰胺生物合成中的第一步。ATP分子中含有的兩個(gè)高能磷酸鍵可以供給生物體活動(dòng)時(shí)所 需能量，也可供給磷酸基。
[0022] 嗜熱乳桿菌（Lactobacillusthermophilus)ATCC8317同黃色短桿菌的GA激酶活 性、ATP含量和GM產(chǎn)量之間的關(guān)系同表1所示：
[0023]表 1:
[0024]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種利用嗜熱乳桿菌從L-谷氨酸生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)L-谷氨酰胺的方法，其特征在該 方法是以L-谷氨酸為反應(yīng)底物，以嗜熱乳桿菌全細(xì)胞為生化反應(yīng)的酶進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn) L-谷氨酰胺。
2. 按照權(quán)利要求1所述的利用嗜熱乳桿菌從L-谷氨酸生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)L-谷氨酰胺的 方法，其特征在于上述嗜熱乳桿菌全細(xì)胞的制備方法為：首先將斜面保存的嗜熱乳桿菌進(jìn) 行搖瓶種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)，然后離心分離，菌體破碎得到。
3. 按照權(quán)利要求2所述的利用嗜熱乳桿菌從L-谷氨酸生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)L-谷氨酰胺的 方法，其特征在于上述搖瓶種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基組成為：酪朊水解物10 g/L， 酵母膏5 g/L，牛肉膏5 g/L，葡萄糖20 g/L，檸檬酸二銨2 g/L，吐溫80 LO mL/L，KH2P04 6 g/L, MgS04 · 7 H20 0· 58 g/L，MnS04 · 4H20 0· 15 g/L，F(xiàn)eS04 · 7H20 0· 03 g/L，L-谷氨 酸鈉25g/L。
4. 按照權(quán)利要求2或3所述的利用嗜熱乳桿菌從L-谷氨酸生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)L-谷氨 酰胺的方法，其特征在于上述發(fā)酵培養(yǎng)條件為：發(fā)酵液接種量為5%~15%，pH值為5. 5~ 6. 5,培養(yǎng)溫度為40°C~45°C，通風(fēng)量為0. 2~I. 5vvm，攪拌轉(zhuǎn)速為100~200r/min，發(fā)酵 時(shí)間為15~24h。
5. 按照權(quán)利要求2所述的利用嗜熱乳桿菌從L-谷氨酸生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)L-谷氨酰胺 的方法，其特征在于上述離心分離是指在4000~6000r/min，4~6°C下離心10~15分鐘。
6. 按照權(quán)利要求2所述的利用嗜熱乳桿菌從L-谷氨酸生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)L-谷氨酰胺 的方法，其特征在于上述菌體破碎采用超聲波破碎，超聲波工作頻率20~25KHz，功率為 500W~800W，間歇時(shí)間為30s~35s，破碎時(shí)間為10~15min。
7. 按照權(quán)利要求1所述的利用嗜熱乳桿菌從L-谷氨酸生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)L-谷氨酰胺 的方法，其特征在于所述生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)過(guò)程為：首先配制質(zhì)量百分比濃度為15%~20%的 L-谷氨酸的水溶液，然后加入其質(zhì)量的30%~40%的硫酸銨，用堿調(diào)整pH值為5. 8~6. 0， 最后加入L-谷氨酸質(zhì)量的10%~15%的嗜熱乳桿菌全細(xì)胞，在溫度45°C~50°C，攪拌轉(zhuǎn)速 200~300r/min的轉(zhuǎn)化條件下進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化。
8. 按照權(quán)利要求1或7所述的利用嗜熱乳桿菌從L-谷氨酸生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)L-谷氨 酰胺的方法，其特征是：在生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中流加氨水。
9. 按照權(quán)利要求8所述的利用嗜熱乳桿菌從L-谷氨酸生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)L-谷氨酰胺的 方法，其特征是：在生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)開始5h后，根據(jù)pH值的變化情況流加一定量的氨水，使反 應(yīng)體系的pH值保持在5. 8~6. 0。
10. 按照權(quán)利要求8所述的利用嗜熱乳桿菌從L-谷氨酸生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)L-谷氨酰胺 的方法，其特征在于在生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中，當(dāng)轉(zhuǎn)化體系連續(xù)3小時(shí)pH值的變化小于0. 1時(shí)，反 應(yīng)終止。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種利用嗜熱乳桿菌從L-谷氨酸生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)L-谷氨酰胺的方法，其特征在該方法是以L-谷氨酸為反應(yīng)底物，以嗜熱乳桿菌全細(xì)胞為生化反應(yīng)的酶進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-谷氨酰胺。本發(fā)明建立了一種直接以L-谷氨酸為底物，通過(guò)嗜熱乳桿菌（Lactobacillus thermophilus ）全細(xì)胞酶轉(zhuǎn)化，直接生物合成L-谷氨酰胺的方法。本發(fā)明方法生產(chǎn)周期短，原料成本和設(shè)備成本低廉，生產(chǎn)效率很高，產(chǎn)物積累濃度高，最終L-谷氨酰胺的產(chǎn)物積累濃度可達(dá)150g/L，對(duì)L-谷氨酸的分子轉(zhuǎn)化率可達(dá)80%，具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景十分廣闊。<u/>
【IPC分類】C12R1-225, C12P13-14
【公開號(hào)】CN104830923
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510211672
【發(fā)明人】仇俊鵬, 高建濤, 陳桃生, 王唐, 廖飛, 徐振華
【申請(qǐng)人】寧夏誠(chéng)志萬(wàn)勝生物工程有限公司
【公開日】2015年8月12日
【申請(qǐng)日】2015年4月29日