一種誘導(dǎo)辣椒疫霉菌產(chǎn)生毒性分泌蛋白的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物保護(hù)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)是一種誘導(dǎo)辣椒疫霉菌產(chǎn)生毒性分泌蛋 白的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 辣椒疫病是一種世界范圍內(nèi)普遍發(fā)生的毀滅性真菌病害，其首先于1918年在美 國(guó)新墨西哥州發(fā)現(xiàn)，引起辣椒疫病的辣椒疫霉菌從oraLeonian是Leon Leonian于1922年命名的，它屬于植物病原卵菌。辣椒疫霉以卵孢子或厚垣孢子在土壤病 殘?bào)w中越冬，可以存活數(shù)月甚至更長(zhǎng)時(shí)間，寄主范圍廣，主要侵染辣椒、番茄、茄子、黃瓜、南 瓜等多種重要蔬菜作物。辣椒疫病露地和保護(hù)地均能發(fā)生，該病的流行致使辣椒損失嚴(yán)重， 一般病株率為15-30%，嚴(yán)重時(shí)達(dá)80%以上。自1980年以來(lái)，辣椒疫病在我國(guó)蔬菜種植區(qū) 域發(fā)病程度日趨加重，嚴(yán)重影響了蔬菜種植業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益，給我國(guó)的蔬菜安全生產(chǎn)造成了 巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，辣椒疫霉菌受到各國(guó)植物病理學(xué)家和遺傳學(xué)家的高度廣泛關(guān)注。辣 椒疫霉菌由于全基因測(cè)序已經(jīng)完成，目前已成為分子生物學(xué)和遺傳學(xué)的良好實(shí)驗(yàn)材料，疫 霉菌-植物互作研宄已成為卵菌病害研宄的模式系統(tǒng)。
[0003] 通過(guò)對(duì)疫霉菌分泌毒性相關(guān)蛋白的功能研宄，可深入了解辣椒疫霉菌的致病機(jī) 制、并以此為靶標(biāo)尋找到辣椒中與該毒性蛋白相對(duì)應(yīng)的抗性基因，上述研宄為弄清植物與 病原物之間的互作機(jī)制和抗病機(jī)制，預(yù)測(cè)病菌群體遺傳變異、不同耕作條件下毒性蛋白變 化、毒性蛋白誘導(dǎo)過(guò)敏反應(yīng)的功能域和寄主相應(yīng)抗病基因的抗性持久性提供基礎(chǔ)。通過(guò)解 析辣椒疫霉菌中編碼的致病相關(guān)因子的分子機(jī)制，可以為尋找殺菌劑的新作用靶點(diǎn)，最終 為有效控制疫病的爆發(fā)提出新的策略。但是目前的研宄表明，誘導(dǎo)辣椒疫霉菌分泌產(chǎn)生大 量毒性蛋白的方法缺失限制了我們對(duì)其致病機(jī)理的深入研宄。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為滿足辣椒疫霉菌在固體培養(yǎng)條件下無(wú)法大量產(chǎn)生毒性分泌蛋白的實(shí)際情況，本 發(fā)明提供一種能夠誘導(dǎo)辣椒疫霉病菌產(chǎn)生毒性分泌蛋白的方法。
[0005] 本發(fā)明的誘導(dǎo)辣椒疫霉菌產(chǎn)生毒性分泌蛋白的步驟如下： ⑴將辣椒疫病病株莖基部表面先用手術(shù)刀片刮掉病株莖基部表面，再用自來(lái)水沖洗 干凈，等自然風(fēng)干后從病健交界處取〇. 4-0. 6cm組織塊置于V8培養(yǎng)基，置于25°C黑暗條件 下培養(yǎng)3-4天，再接種到V8培養(yǎng)基上，置于28°C黑暗條件下培養(yǎng)3-4天，直到形成較大的 菌落； ⑵形成較大的菌落后，將20塊直徑為5mm菌碟轉(zhuǎn)接到150mL毒性蛋白液體誘導(dǎo)培 養(yǎng)基中，于25°C，150rpm振蕩培養(yǎng)15-20天，毒性分泌蛋白液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基主要成分：酵母 提取物 〇? 4-0. 8g，KH2P04 0? 5-0. 7g，MgS04. 7H20 0? 15-0. 3g，VB1 0? 001-0. 002g，葡萄 糖20-30g，天冬酰胺lg，谷留醇0.01-0.02g，定容到1000ml; ⑶用Whatman濾紙過(guò)濾，濾液經(jīng)8000rpm離心30min，上清液加入100%飽和硫酸銨溶 液至硫酸銨終濃度為33%，于12000rpm離心30min，沉淀經(jīng)透析帶1KD處理，凍干后獲得辣 椒疫霉菌毒性分泌蛋白提取物，-70°C保存。
[0006] ⑷將蛋白提取物用200UL去離子水溶解后，在成株期煙草葉片上進(jìn)行接種實(shí) 驗(yàn)，驗(yàn)證獲得蛋白的特性。
[0007] 所述的V8培養(yǎng)基為V8蔬菜汁150mL，CaC03 0? 2g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL。
[0008] 本發(fā)明解決了辣椒疫霉菌在固體培養(yǎng)條件下不產(chǎn)生大量毒性分泌蛋白的問(wèn)題，通 過(guò)對(duì)液體培養(yǎng)基配方調(diào)整，加入微量無(wú)機(jī)鹽及氨基酸，從而誘導(dǎo)辣椒疫霉菌產(chǎn)生大量毒性 分泌蛋白。通過(guò)對(duì)毒性蛋白的分離和提純，可以深入研宄辣椒疫霉菌與寄主之間在蛋白質(zhì) 水平上的相互作用，揭示兩者在激發(fā)子信號(hào)識(shí)別和傳導(dǎo)過(guò)程中的相關(guān)調(diào)控機(jī)理，對(duì)疫霉菌 致病機(jī)理的研宄具有重要意義。
【具體實(shí)施方式】
[0009] 將分離的辣椒疫霉菌在V8固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，然后將菌碟轉(zhuǎn)入毒性分泌蛋白液 體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，最后分離和提純辣椒疫霉菌毒性分泌蛋白，蛋白提取物在煙草葉片 上接種，調(diào)查壞死斑。
[0010] 實(shí)施例1: 將辣椒疫病病株莖基部表面先用手術(shù)刀片刮掉病株莖基部表面，再用自來(lái)水沖洗干 凈，等自然風(fēng)干后從病健交界處取0. 5cm組織塊置于V8培養(yǎng)基，置于25°C黑暗條件下培 養(yǎng)4天，15% (終濃度）固體V8培養(yǎng)基主要由以下幾部分組成：V8蔬菜汁(購(gòu)于金寶湯公司， 美國(guó)）150mL，CaC03 0. 2g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL;將分離獲得的辣椒疫霉菌弱致病菌 株FZ-1 (自己分離）再接種到V8培養(yǎng)基上，置于25°C黑暗條件下培養(yǎng)4天，直到形成較大 的菌落；將20塊直徑為5mm菌碟轉(zhuǎn)接到150mL毒性蛋白液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，于25°C，150 rpm振蕩培養(yǎng)18天，毒性分泌蛋白液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基主要成分：酵母提取物0. 6g，KH2P04 0.6g，MgS04.7H20 0.25g，VB1 0.001g，葡萄糖 25g，天冬酰胺lg，fi-谷甾醇 0.01g， 定容到l〇〇〇ml;用Whatman濾紙過(guò)濾，濾液經(jīng)8000rpm離心30min，上清液加入100%飽和硫 酸按溶液(硫酸按終濃度為33%)，于12000rpm離心30min，沉淀經(jīng)透析帶1KD處理，凍干后 獲得辣椒疫霉菌毒性分泌蛋白提取物，-70 °C保存。
[0011] 實(shí)施例2: 將辣椒疫病病株莖基部表面先用手術(shù)刀片刮掉病株莖基部表面，再用自來(lái)水沖洗干 凈，等自然風(fēng)干后從病健交界處取〇. 5 cm組織塊置于V8培養(yǎng)基，置于25°C黑暗條件下培 養(yǎng)3天，將分離獲得的辣椒疫霉菌強(qiáng)致病菌株ND-2, XM-3接種到15%固體V8培養(yǎng)基（V8蔬 菜汁150 mL，CaC03 0. 2 g，瓊脂20 g和蒸餾水1000 mL)上，置于25°C黑暗條件下培養(yǎng)3 天，直到形成較大的菌落；將20塊直徑為5 mm菌碟轉(zhuǎn)接到150 mL毒性蛋白液體誘導(dǎo)培養(yǎng) 基中，于25°C，150 rpm振蕩培養(yǎng)20天，毒性分泌蛋白液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基主要成分：酵母提取 物0.8 g，KH2P04 0.7 g，MgS04.7H200.3 g，VB10.002 g，葡萄糖30 g，天冬酰胺lg，fi-谷甾 醇0.02 g,定容到1000ml ;用Whatman濾紙過(guò)濾，濾液經(jīng)8000rpm離心30min，上清液加入 100%飽和硫酸銨溶液(硫酸銨終濃度為33%)，于12000 rpm離心30min，沉淀經(jīng)透析帶1KD 處理，凍干后獲得辣椒疫霉菌毒性分泌蛋白提取物，-70°C保存。
[0012] 將上述實(shí)施例1和2所提純并保存的毒性分泌蛋白接種到本氏煙草葉片上，接種3 天后調(diào)查壞死斑大小，結(jié)果表明壞死斑由內(nèi)至外，依次形成灰白斑、水漬圈和褐斑圈的感病 癥狀，而且菌株致病性越強(qiáng)，誘導(dǎo)蛋白致病性也越強(qiáng)。壞死斑大小見(jiàn)下表：
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種誘導(dǎo)辣椒疫霉菌產(chǎn)生毒性分泌蛋白的方法，其特征在于所述方法包括以下步 驟： ⑴將辣椒疫病病株莖基部表面用手術(shù)刀片刮掉，再用自來(lái)水沖洗干凈，干凈的莖桿經(jīng) 風(fēng)干后從病健交界處取0. 4-0. 6 cm組織塊置于V8固體培養(yǎng)基，置于25°C黑暗條件下培養(yǎng) 3-4天，獲得的辣椒疫霉菌菌株，再接種到V8固體培養(yǎng)基上，置于25°C黑暗條件下培養(yǎng)3-4 天，直到形成較大的菌落； ⑵形成較大的菌落后，將20塊直徑為5 mm菌碟放到含有150ml的毒性分泌蛋白誘導(dǎo) 培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，于25°C，150rpm培養(yǎng)15-20天； ⑶用Whatman濾紙過(guò)濾，濾液經(jīng)8000rpm離心30min，上清液加入100%飽和硫酸銨溶 液至硫酸銨終濃度為33%，于12000 rpm離心30min，沉淀經(jīng)透析帶IKD處理，凍干后獲得辣 椒疫霉菌毒性分泌蛋白提取物，-70°C保存。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種誘導(dǎo)辣椒疫霉菌產(chǎn)生毒性分泌蛋白的方法，其特征 在于：所述的毒性分泌蛋白液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基主要成分：酵母提取物0.4-0. 8 g，KH2PO40.5-0. 7 g，MgS04.7H20 0.15-0.3 g，VBl 0.001-0.002 g，葡萄糖 20-30 g，天冬酰胺 lg， β-谷甾醇 0.01-0.02 g,定容到 1000ml。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種誘導(dǎo)辣椒疫霉菌產(chǎn)生毒性分泌蛋白的方法，將辣椒疫病病組織帶回實(shí)驗(yàn)室，先用手術(shù)刀片刮掉病株莖基部表面，再用自來(lái)水沖洗干凈，從病健交界處取0.5cm組織塊置于V8培養(yǎng)基，25℃黑暗條件下培養(yǎng)3-4天，直到形成較大的菌落后，將菌碟轉(zhuǎn)接到毒性蛋白液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)15-20天，用濾紙濾去菌絲體，濾液經(jīng)8000rp，離心30min，上清液加入飽和硫酸銨，12000rpm離心30min，沉淀經(jīng)透析處理，凍干后獲得辣椒疫霉菌分泌的毒性蛋白，-70℃保存。上述方法可以誘導(dǎo)辣椒疫霉菌產(chǎn)生大量毒性分泌蛋白，填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)外辣椒疫霉菌致病機(jī)理研究中不能獲得大量毒性分泌蛋白的空白，具有重大意義。
【IPC分類】C12R1-645, C12P21-00
【公開(kāi)號(hào)】CN104830932
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510248353
【發(fā)明人】劉裴清, 陳慶河, 李本金, 丁雪玲, 翁啟勇
【申請(qǐng)人】福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所
【公開(kāi)日】2015年8月12日
【申請(qǐng)日】2015年5月16日