一種鑒定藍(lán)莓耐熱品種的標(biāo)記基因及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種鑒定藍(lán)莓耐熱品種的標(biāo)記基因0-型硫氧還蛋白（TRXo)及其應(yīng) 用，屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 藍(lán)莓（Vacciniumspp.)作為新興水果，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與經(jīng)濟(jì)效益，由于藍(lán) 莓獨(dú)特的保健作用，在美國(guó)和日本等發(fā)達(dá)國(guó)家是最流行的小水果之一，且被國(guó)際糧農(nóng)組織 列為人類(lèi)五大健康食品之一，堪稱(chēng)"世界第三代水果之王"。藍(lán)莓原產(chǎn)于北方寒冷地區(qū)，在亞 熱帶地區(qū)種植藍(lán)莓不但可使其生長(zhǎng)期延長(zhǎng)，并大大提前了果實(shí)成熟期，在國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上藍(lán)莓 正處于高價(jià)位時(shí)期。但由于亞熱帶地區(qū)夏季天氣燥熱，日照強(qiáng)烈，氣溫可高達(dá)35~39°C，有 時(shí)甚至達(dá)到40°C以上，對(duì)藍(lán)莓造成生長(zhǎng)停滯，甚至導(dǎo)致其死亡。高溫是限制藍(lán)莓生長(zhǎng)和產(chǎn)量 的主要環(huán)境因素之一，近年來(lái)，溫室效應(yīng)導(dǎo)致全球性氣溫上升和中國(guó)藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)的南移，對(duì)于 耐熱藍(lán)莓品種的篩選和耐熱新品種的培育顯得尤為重要。而常規(guī)田間自然鑒定法，雖然具 有操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，但該方法需要栽培幾年后才能評(píng)價(jià)，并且只有大面積栽培才能保證結(jié) 果的準(zhǔn)確性，因此常常需要耗費(fèi)大量的人力物力，還存在實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)等缺點(diǎn)。而通過(guò)耐熱標(biāo) 記基因?qū)δ蜔崴{(lán)莓品種篩選具有快捷、方便和準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。最近，浙江師范大學(xué)藍(lán)莓課題組 在對(duì)高溫脅迫條件下藍(lán)莓的生理生化和分子相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)TRXo在不同藍(lán)莓 品種中能夠穩(wěn)定的上調(diào)表達(dá)，且發(fā)現(xiàn)耐熱能力越強(qiáng)的藍(lán)莓品種上調(diào)量越大，這為開(kāi)發(fā)一種 鑒定藍(lán)莓耐熱品種的分子方法提供了一種思路。
[0003] 硫氧還蛋白（TRX)是一類(lèi)廣泛存在于生物體內(nèi)的多功能酸性蛋白，分子量約 12kDa，參與細(xì)胞的一系列生化反應(yīng)。蛋白質(zhì)中Cys氧化產(chǎn)物的還原需要TRX和NTR進(jìn)行， 且活性氧清除體系中的抗氧化酶富含Cys，TRX可使其還原后恢復(fù)清除R0S的活性。TRX中 TRXf、m、x、y和z定位于葉綠體，而TRXh不僅存在于細(xì)胞質(zhì)，還存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體中， TRXo和NTR則是新近發(fā)現(xiàn)的線粒體蛋白。研宄表明Trx具有基本的氧化還原功能之外，還 有許多其他生物學(xué)活性，通過(guò)參與若干生理過(guò)程而發(fā)揮重要的生物學(xué)功能，包括調(diào)節(jié)抗氧 化作用、抗脅迫作用、參與細(xì)胞凋亡過(guò)程和調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合活性等。研宄表明TRX在 植物抵抗高溫、干旱和低溫等非生物脅迫中起到非常重要的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是針對(duì)上述存在的問(wèn)題提供一種在高溫脅迫下的不同耐熱性藍(lán) 莓品種中上調(diào)表達(dá)且程度不同的標(biāo)記基因0-型硫氧還蛋白（TRXo)的序列引物，并利用 該引物進(jìn)行藍(lán)莓品種是否是耐熱品種的鑒定方法，采用實(shí)時(shí)定量基因擴(kuò)增熒光檢測(cè)技術(shù) (qRT-PCR)，對(duì)該標(biāo)記基因在待檢測(cè)藍(lán)莓品種中的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)和分析，進(jìn)行鑒定待檢測(cè) 藍(lán)莓品種的耐熱性。
[0005] 上述目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0006] 1.提供一種在高溫脅迫條件下的不同藍(lán)莓品種中上調(diào)表達(dá)且程度不同的標(biāo)記基 因0-型硫氧還蛋白（TRXo)，其核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示。
[0007] 2.針對(duì)上述基因的核苷酸序列，進(jìn)行qRT-PCR引物的設(shè)計(jì)，SEQIDNo. 2和SEQID No. 3 (見(jiàn)表 1)。
[0008] 3.人工模擬氣候45°C熱脅迫處理待檢測(cè)藍(lán)莓6h，并提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA作 為模板；以GAPDH為內(nèi)參基因（SEQIDNo. 4和SEQIDNo. 5,見(jiàn)表1)，進(jìn)行qRT-PCR鑒定。 若標(biāo)記基因在待測(cè)藍(lán)莓品種葉片中的表達(dá)模式為上調(diào)表達(dá)，且表達(dá)量高于5倍及以上，則 表明該藍(lán)莓品種是耐熱品種。
[0009] 表1進(jìn)行qRT-PCR的相關(guān)引物
[0010]
[0011] 有益效果：
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種鑒定藍(lán)莓耐熱品種的標(biāo)記基因 O-型硫氧還蛋白，其特征在于，其核苷酸序列 SEQ ID NO. 1。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鑒定藍(lán)莓耐熱品種的標(biāo)記基因〇-型硫氧還蛋白，其特征 在于，其能夠在高溫脅迫下的不同耐熱性藍(lán)莓品種中上調(diào)表達(dá)且程度不同。
3. -對(duì)鑒定藍(lán)莓耐熱品種的標(biāo)記基因〇-型硫氧還蛋白的qRT-PCR引物，其特征在于， 以其CDS序列為模板，進(jìn)行qRT-PCR引物的設(shè)計(jì)，引物序列如SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 3 所示。
4. 一種鑒定藍(lán)莓耐熱品種的標(biāo)記基因的應(yīng)用，其特征在于，人工模擬氣候45°C熱脅迫 處理待檢測(cè)藍(lán)莓6 h，并提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA作為模板；以似/??為內(nèi)參基因，其引物 序列為SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5,以權(quán)利要求3所述序列為引物，進(jìn)行qRT-PCR鑒定，以 大連寶生物熒光定量試劑盒RR82LR為例： qRT-PCR反應(yīng)體系如下： SEQ ID No. 2/ SEQ ID No. 4 (10 μM) 0. 4 μ L SEQ ID No. 3/ SEQ ID No. 5 (10 μ Μ) 0. 4 μ L cDNA 模板 1.0 yL SYBRVrefflix Ex Taq II (2Χ) (Tli ENaseH Plus), ROX plus 10 μ L ddH20 8· 2 μ L 反應(yīng)條件：95°C 30 s; 95°C 5 s，58°C 35 s，總共40個(gè)循環(huán)，進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，并 使用法進(jìn)行計(jì)算分析。
5. -種鑒定藍(lán)莓耐熱品種的標(biāo)記基因在藍(lán)莓耐熱品種篩選中的應(yīng)用，其特征在于， 以在適宜溫度栽培條件下的藍(lán)莓為對(duì)照，45°C高溫脅迫6 h的藍(lán)莓為待檢測(cè)材料，提取 兩者葉片總RNA，并反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以此為模板，以鑒定藍(lán)莓耐熱品種的標(biāo)記基因特異序 列片段為引物，以似/??為內(nèi)參基因，進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，并使用2 4 Aet法進(jìn)行計(jì)算分析； 如果鑒定藍(lán)莓耐熱品種的標(biāo)記基因〇-型硫氧還蛋白的表達(dá)模式在待檢測(cè)品種中為上調(diào)表 達(dá)，且表達(dá)倍數(shù)大于等于5,則表明該藍(lán)莓品種為耐熱品種，說(shuō)明該藍(lán)莓品種可在亞熱帶等 地區(qū)種植栽培，或育種得到的新品種具有較高的耐熱性；證明〇-型硫氧還蛋白基因是一個(gè) 可以廣泛用于鑒定藍(lán)莓品種耐熱性的標(biāo)記基因。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種鑒定藍(lán)莓耐熱品種的標(biāo)記基因及其應(yīng)用，屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域。利用該標(biāo)記基因，即o-型硫氧還蛋白（TRXo），能夠在高溫脅迫下的不同耐熱性藍(lán)莓品種中上調(diào)表達(dá)且程度不同的特性。以該基因CDS序列為模板設(shè)計(jì)引物，檢測(cè)方法：人工模擬氣候45℃熱脅迫處理藍(lán)莓6 h，并提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA作為模板，進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，并用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算分析。通過(guò)分析該基因在熱脅迫和對(duì)照下的表達(dá)量的比值，若比值大于等于5，該藍(lán)莓品種可鑒定為耐熱品種。該方法相較于田間自然鑒定法更快捷、穩(wěn)定和準(zhǔn)確，是快速篩選耐熱品種進(jìn)行推廣種植和耐熱新品種育種的基礎(chǔ)。
【IPC分類(lèi)】C12Q1-68, C12N15-53, C12N15-11
【公開(kāi)號(hào)】CN104830979
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510207933
【發(fā)明人】陳文榮, 余柯達(dá), 朱心怡, 吳潔慧, 陳曉青
【申請(qǐng)人】浙江師范大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年8月12日
【申請(qǐng)日】2015年4月28日