Kras基因多點(diǎn)突變單管快速檢測方法及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種突變檢測試劑盒，特別涉及一種KRAS多點(diǎn)突變單管快速檢測試 劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] KRAS基因位于人類12號(hào)染色體上，是人腫瘤中常見的致癌基因。KRAS基因正常 時(shí)，能控制調(diào)控細(xì)胞生長的路徑，可抑制腫瘤細(xì)胞生長。當(dāng)發(fā)生突變時(shí)，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)信號(hào) 傳導(dǎo)紊亂，細(xì)胞增殖失控而癌變。 結(jié)直腸癌（colorectalcancer,CRC)是目前世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤 之一，40%以上的結(jié)直腸癌患者確診時(shí)腫瘤已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移而失去根治性手術(shù)治療的機(jī)會(huì)。目 前，分子靶向治療已經(jīng)成為國際國內(nèi)轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌治療的共識(shí)。如靶向EGFR的單克隆抗 體藥物西妥昔單抗(商品名愛必妥）已經(jīng)成為轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌治療中的一線用藥。
[0003] 由于KRAS野生型的患者是抗EGFR單抗藥物治療的最大獲益人群，KRAS基因大多 數(shù)的突變發(fā)生在2號(hào)外顯子12、13密碼子上，所以在使用抗EGFR單抗藥物治療前，2011年 NCCN《結(jié)腸癌臨床實(shí)踐指南（中國版)》推薦進(jìn)行KRAS基因第12和13號(hào)密碼子的突變檢 測，從而基于患者腫瘤DNA中KRAS基因的突變狀態(tài)來指導(dǎo)臨床制定合適的治療方案。
[0004] KRAS基因藥物敏感的突變點(diǎn)，目前普遍認(rèn)為需檢測7個(gè)突變位點(diǎn)，市面上的熒光 PCR檢測試劑盒普遍使用7個(gè)PCR管進(jìn)行檢測，分析過程繁瑣而且沒有必要。同時(shí)整個(gè)檢測 流程較慢，至少需要2天才能出結(jié)果。
[0005] 本專利使用多點(diǎn)突變并行檢測技術(shù)，在單管中，可通過熒光基團(tuán)的指示作用，在同 一個(gè)PCR反應(yīng)中，即可同時(shí)檢測出多個(gè)突變位點(diǎn)。不需分開幾個(gè)PCR管分別進(jìn)行。實(shí)現(xiàn)簡 單，方便的KRAS點(diǎn)突變檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種高效的KRAS多點(diǎn)突變單管快速檢測方法及試劑盒。
[0007] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是： 多點(diǎn)突變單管快速檢測方法，包括如下步驟： 1) 設(shè)計(jì)針對不同點(diǎn)突變的ARMS引物及對應(yīng)的下游引物、中介連接引物、通用熒光探 針及其淬滅探針；其中，中介連接引物由通用序列部分和特異序列部分構(gòu)成，通用序列部分 與通用熒光探針部分序列互補(bǔ)，特異序列部分與點(diǎn)突變下游的部分序列互補(bǔ)； 2) 將ARMS引物及對應(yīng)的下游引物、中介連接引物、通用熒光探針及其淬滅探針與熱 啟動(dòng)快速Taq酶系統(tǒng)混合，擴(kuò)增； 3) 檢測反應(yīng)體系的熒光變化，確定是否存在點(diǎn)突變。
[0008] ARMS弓丨物對應(yīng)的下游引物、中介連接引物、通用熒光探針優(yōu)為簡并的，即一條下 游引物、中介連接引物、通用熒光探針可以對應(yīng)于多條。
[0009] 作為上述方法的進(jìn)一步改進(jìn)，通用熒光探針上連接熒光基團(tuán)的核苷酸和淬滅探針 上連接淬滅基團(tuán)的核苷酸在互補(bǔ)配對后的間距不超過4個(gè)核苷酸，進(jìn)一步的，不超過3個(gè)、 2個(gè)、1個(gè)或連接在相互配對的兩個(gè)核苷酸上。
[0010] 作為上述方法的進(jìn)一步改進(jìn)，中介連接引物中與突變位點(diǎn)下游的部分序列互補(bǔ)的 核酸數(shù)量不少于5bp，不少于10bp，特別的，互補(bǔ)的核酸數(shù)量為15~30bp。
[0011] 作為上述方法的進(jìn)一步改進(jìn)，中介連接引物中與通用熒光探針部分核酸互補(bǔ)配對 的核酸數(shù)量不少于5bp，不少于10bp，特別的，互補(bǔ)的核酸數(shù)量為15~45bp。
[0012] 互補(bǔ)序列的存在，有利于保證引物間存在足夠的親和力，保證檢測結(jié)果的可靠性。
[0013] 作為上述方法的進(jìn)一步改進(jìn)，通用熒光探針的一端連接有保護(hù)核酸序列。保護(hù)序 列的作用在于防止探針的關(guān)鍵序列不被反應(yīng)體系中無意引入的核酸外切酶過早切除。保護(hù) 序列不與待測序列、引物等互補(bǔ)配對，可以是簡單重復(fù)序列，如多個(gè)A、T、C、G等。
[0014] 一種KRAS多點(diǎn)突變單管快速檢測試劑盒，包括DNA提取液，熱啟動(dòng)快速Taq酶系 統(tǒng)和KRAS突變檢測引物，其特征在于：所述KRAS突變檢測引物由多組ARMS引物及對應(yīng)的 下游引物、中介連接引物、通用熒光探針及其淬滅探針組成；其中：中介連接引物的一端序 列與待KRAS突變位點(diǎn)下游的部分序列互補(bǔ)，另一端序列與通用熒光探針部分核酸互補(bǔ)配 對。
[0015] 優(yōu)選的，上述KRAS多點(diǎn)突變單管快速檢測試劑盒中使用的中介連接引物中與 KRAS突變位點(diǎn)下游的部分序列互補(bǔ)的核酸數(shù)量不少于5bp，不少于10bp，特別的，互補(bǔ)的 核酸數(shù)量為15~30bp。
[0016] 優(yōu)選的，上述KRAS多點(diǎn)突變單管快速檢測試劑盒中使用的中介連接引物中與通 用熒光探針部分核酸互補(bǔ)配對的核酸數(shù)量不少于5bp，不少于10bp，特別的，互補(bǔ)的核酸 數(shù)量為15~45bp。
[0017] 特別的，上述KRAS多點(diǎn)突變單管快速檢測試劑盒中使用的ARMS引物的序列如 下： ARMS引物 1:ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGA ARMS引物 2:ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGC ARMS引物 3:ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGT ARMS引物 4:ACTTGTGGTAGTTGGAGCTA ARMS引物 5:ACTTGTGGTAGTTGGAGCTC ARMS引物 6:ACTTGTGGTAGTTGGAGCTT ARMS引物 7:GTGGTAGTTGGAGCTGGTGA ARMS引物1~7對應(yīng)的下游引物為Y1:AITAAAACAAGAITTACCTCTA; ARMS引物1~7對應(yīng)的中介引物為Z1 : GTCAGCCTTGCTAAGGCTACAGCTAATTCAGAATCAo
[0018] 特別的，上述KRAS多點(diǎn)突變單管快速檢測試劑盒中使用的通用熒光探針的序列 為： CT(dA-FAM)GAGCTCTACGTAGCCTTAGCAAGGCTGACTITITITITITTTITITT，對應(yīng)的淬滅序列 為：5'BHQ-GCTCTAG-3'。
[0019] 熱啟動(dòng)快速Taq酶系統(tǒng)的組成為dNTPS(U)、UNG酶、熱啟動(dòng)快速Taq酶。
[0020] 本發(fā)明的有益效果是： 本發(fā)明操作簡單，可以定性檢測出多點(diǎn)突變的存在。本發(fā)明的檢測方法中使用的引物 設(shè)計(jì)難度低，大幅降低了引物合成的成本。
[0021] 本發(fā)明檢測方法克服了現(xiàn)有ARMS技術(shù)的局限性，大大提高了其檢測通量。
[0022] 本發(fā)明的檢測方法實(shí)現(xiàn)了多管檢測反應(yīng)的簡易性，1管反應(yīng)取代了之前的多管檢 測，節(jié)省人力物力。
[0023] 本發(fā)明的檢測方法中使用快速Taq酶，比普通Taq酶更好。
【附圖說明】
[0024] 圖1到圖6是本發(fā)明檢測方法的原理圖； 圖7是等濃度模板在不同Taq酶反應(yīng)條件下的PCR擴(kuò)增曲線，說明本試劑盒中使用的 快速Taq酶比普通Taq酶的擴(kuò)增效果好。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面結(jié)合附圖，進(jìn)一步說明本發(fā)明的檢測原理。
[0026] 以KRAS突變點(diǎn)12Asp為例，該點(diǎn)的野生型為G，突變型為A，在PCR過程中，首先使 用1對引物，含1條針對突變點(diǎn)的ARMS引物（引物最后一個(gè)堿基為A)和下游引物。該引物 在快速酶的作用下特異性的擴(kuò)增出突變位點(diǎn)A。野生型位點(diǎn)G不被擴(kuò)增，如圖1所示； 當(dāng)特異性擴(kuò)增發(fā)生后，在ARMS引物的引導(dǎo)下，快速Taq酶沿著DNA模板，向5'_3'方向 移動(dòng)并水解中介連接引物的序列介導(dǎo)區(qū)域，而中介連接引物的探針互補(bǔ)區(qū)域則被釋放，如 圖2、圖3所示； 釋放出來的探針互補(bǔ)區(qū)域，基于堿基互補(bǔ)配對原則，與通用熒光探針發(fā)生互補(bǔ)，在淬滅 基團(tuán)的存在下，熒光基團(tuán)的熒光被淬滅，如圖4所示； 快速Taq酶通過中介連接引物的探針互補(bǔ)區(qū)域，向5' -3'方向移動(dòng)，水解淬滅基團(tuán)，從 而淬滅基團(tuán)遠(yuǎn)離熒光基團(tuán)，從而PCR反應(yīng)產(chǎn)生了熒光，如圖5、圖6所示。
[0027] 因此，只要多個(gè)個(gè)突變位點(diǎn)的ARMS引物、下游引物和中介連接引物，1組通用熒光 探針與通用淬滅互補(bǔ)探針，可以置于一個(gè)PCR反應(yīng)管中，即可以檢測出樣本中是否存在點(diǎn) 突變，顯著提高了ARMS法的檢測通量。
[0028] 實(shí)施例1 1.KRAS多點(diǎn)突變單管快速檢測試劑盒，主成分如下： 1) DNA提取液： 50mMNa0H、10mMTris-HCl(PH8.0)、l%NP-40、6%Chelex、0.1mMEDTA(PH8.0)組成 2) 快速Taq酶系統(tǒng)： 3U的快速Taq，0. 5ul的dNTPs(25mM) 3) 引物： KRASARMS引物及對應(yīng)的下游引物： 中介連接引物：
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 多點(diǎn)突變單管快速檢測方法，包括如下步驟： a)設(shè)計(jì)針對不同點(diǎn)突變的ARMS引物及對應(yīng)的下游引物、中介連接引物和通用熒光探 針，其中，中介連接引物由與通用熒光探針部分序列互補(bǔ)的通用序列部分和與點(diǎn)突變下游 的部分序列互補(bǔ)的特異部分組成；b)將ARMS引物及對應(yīng)的下游引物、中介連接引物和通用 熒光探針與快速Taq酶系統(tǒng)混合，擴(kuò)增；c)檢測反應(yīng)體系的熒光變化，確定是否存在點(diǎn)突 變。
2. -種KRAS多點(diǎn)突變單管快速檢測試劑盒，包括DNA提取液，快速Taq酶系統(tǒng)和KRAS 突變檢測引物，其特征在于：所述KRAS突變檢測引物由多組ARMS引物及對應(yīng)的下游引物、 中介連接引物，以及通用熒光探針組成，其中： 中介連接引物的一端序列與待KRAS突變位點(diǎn)下游的部分序列互補(bǔ)，另一端序列與通 用熒光探針部分核酸互補(bǔ)配對。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的KRAS多點(diǎn)突變單管快速檢測試劑盒，其特征在于：快速Taq 酶系統(tǒng)的組成為dNTPS (U)、UNG酶、快速Taq酶。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的KRAS多點(diǎn)突變單管快速檢測試劑盒，其特征在于：中介連接 引物中與KRAS突變位點(diǎn)下游的部分序列互補(bǔ)的核酸數(shù)量不少于5 bp。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的KRAS多點(diǎn)突變單管快速檢測試劑盒，其特征在于：中介連接 引物中與KRAS突變位點(diǎn)下游的部分序列互補(bǔ)的核酸數(shù)量為15~30bp。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的KRAS多點(diǎn)突變單管快速檢測試劑盒，其特征在于：中介連接 引物中與通用熒光探針部分核酸互補(bǔ)配對的核酸數(shù)量不少于5 bp。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的KRAS多點(diǎn)突變單管快速檢測試劑盒，其特征在于：中介連接 引物中與通用熒光探針部分核酸互補(bǔ)配對的核酸數(shù)量為15~45bp。
8. 根據(jù)權(quán)利要求2~7任意一項(xiàng)所述的KRAS多點(diǎn)突變單管快速檢測試劑盒，其特征在 于：ARMS引物的序列如下：
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9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的KRAS多點(diǎn)突變單管快速檢測試劑盒，其特征在于：通用熒光 探針的序列為： 5 ' -CT (dA-FAM) GAGCTCTACGTAGCCTTAGCAAGGCTGACTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3 '，對應(yīng)的淬 滅序列為：5' BHQ-GCTCTAG-3'。
【專利摘要】本發(fā)明公開了多點(diǎn)突變單管快速檢測方法及試劑盒。多點(diǎn)突變單管快速檢測方法，包括：1）設(shè)計(jì)ARMS引物及對應(yīng)的下游引物、中介連接引物、通用熒光探針及其淬滅探針；2）將ARMS引物及對應(yīng)的下游引物、中介連接引物、通用熒光探針及其淬滅探針與熱啟動(dòng)快速Taq酶系統(tǒng)混合，擴(kuò)增；3）檢測反應(yīng)體系的熒光變化，確定是否存在點(diǎn)突變。本發(fā)明的發(fā)明，操作簡單，可以定性檢測出多點(diǎn)突變的存在。本發(fā)明的檢測方法中使用的引物設(shè)計(jì)難度低，大幅降低了引物合成的成本；克服了現(xiàn)有ARMS技術(shù)的局限性，大大提高了其檢測通量；實(shí)現(xiàn)了1管反應(yīng)取代了之前的多管檢測，節(jié)省人力物力。
【IPC分類】C12Q1-68, C12N15-11
【公開號(hào)】CN104830981
【申請?zhí)枴緾N201510211543
【發(fā)明人】陳華云, 陳嘉昌, 劉淑園, 肖湘文, 丁渭, 張?zhí)旌? 趙麗, 方鳳銀, 鄧?yán)?
【申請人】廣州和實(shí)生物技術(shù)有限公司
【公開日】2015年8月12日
【申請日】2015年4月29日