植物耐逆性相關(guān)蛋白GmSTOP1及其編碼基因的應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及植物耐逆性相關(guān)蛋白GmSTOPI及其編碼基因的應 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 大豆作為優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)食品和植物油的重要來源，一直是世界各國不容忽視的作物 之一（王利群等，2009)。中國是大豆的發(fā)源地，我國南方大豆產(chǎn)區(qū)地域遼闊，自然條件優(yōu) 越，是我國大豆的主要產(chǎn)區(qū)之一。我國長江以南熱帶、亞熱帶地區(qū)主要為紅色或黃色的酸性 土壤，總面積達1.28億hm 2,占全國土地總面積的22. 7%，占全國耕地面積的28% (金婷婷 等，2007)。酸性土壤中活性Al3+產(chǎn)生的鋁毒害會顯著抑制植物的根系生長，進而抑制地上 部分的生長，是限制作物生長和產(chǎn)量的主要因素之一（Ma et al，2003;陳奇等，2012)。近年 來隨著酸雨發(fā)生頻率變高及酸性和生理酸性肥料的大量施用，使得土壤酸度進一步加劇， 鋁毒害已經(jīng)成為南方酸性土壤中大豆生長發(fā)育的重要限制因素（俞慧娜等，2008)。同時， 鹽堿、干旱等滲透脅迫是影響農(nóng)作物生長發(fā)育繼而限制作物產(chǎn)量的主要非生物脅迫因素， 我國約有1億hm 2的鹽堿土地，干旱、半干旱地區(qū)占全國陸地面積的二分之一（高世慶等， 2005)，嚴重影響著大豆產(chǎn)量。因此，在進行土壤改良的同時，通過分子育種手段提高大豆的 耐逆性，挖掘大豆自身的耐逆相關(guān)基因，選育耐鋁毒能力強的、耐鹽、耐旱的大豆品種對大 豆的生產(chǎn)具有重要意義。
[0003] STOPl-like蛋白是一類含有C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，通過調(diào)控鋁毒耐受 機制和H毒害耐受機制相關(guān)基因的表達，使植物具有對錯毒和H毒害的耐性（Luchi et al，2007 ;Luchi et al，2008 ;Hoekenga et al，2006 ;Magalhaes et al，2007 ;Liu et al， 2009)。Yamaji等（2009)通過突變體分析在水稻中發(fā)現(xiàn)一個與ST0P1類似的鋅指蛋白 OsARTl，它可調(diào)控30多種耐鋁毒基因的表達，增強水稻對鋁毒的抗性。0hyama(2013)等人 利用RNAi技術(shù)沉默NtSTOPl基因后發(fā)現(xiàn)煙草根對鋁毒和H+毒害的耐性、鋁毒脅迫下的根 部檸檬酸分泌量、ALS3等耐鋁毒相關(guān)基因的表達均受到抑制；將百脈根、小立碗蘚、茶樹、 黑楊中的STOPl-like基因分別轉(zhuǎn)入擬南芥突變體stopl中過表達，都能激活耐鋁毒相關(guān)的 AtALMTl、AtMATE和ALS3等基因恢復表達。多個物種中與AtSTOPl同源的基因都可通過調(diào) 控耐錯毒基因的表達提尚植物對錯毒害的耐性，而在大中還未見有關(guān)STOP 1-1 ike基因 的研宄報道，STOPl-like基因是否與除鋁毒外的鹽堿、干旱等其他逆境脅迫相關(guān)更是未見 報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供植物耐逆性相關(guān)蛋白GmSTOPI及 其編碼基因與應用。
[0005] 本發(fā)明的目的通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0006] 植物耐逆性相關(guān)蛋白GmSTOPI在培育耐鋁毒、耐鹽和耐滲透脅迫的大豆品種中的 應用，所述的植物耐逆性相關(guān)蛋白GmSTOPl氨基酸序列如SEQ ID NO. 13所示。
[0007] 編碼植物耐逆性相關(guān)蛋白GmSTOPl的基因在培育耐鋁毒、耐鹽和耐滲透脅迫的大 豆品種中的應用，所述的編碼植物耐逆性相關(guān)蛋白GmSTOPl的基因核苷酸序列如SEQ ID NO. 14所示。
[0008] 含有編碼植物耐逆性相關(guān)蛋白GmSTOPl的基因的重組表達載體在培育耐鋁毒、耐 鹽和耐滲透脅迫的大豆品種中的應用，所述的編碼植物耐逆性相關(guān)蛋白GmSTOPl的基因核 苷酸序列如SEQIDN0. 14所示。
[0009] 有益效果：
[0010] 本發(fā)明所提供的植物耐逆性相關(guān)蛋白編碼基因GmSTOPl讀碼框長度為1566bp，其 編碼蛋白含有與其他STOP-like蛋白高度同源的Cys-2-His-2鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域，定位于細 胞核內(nèi)。
[0011] 擬南芥是一種模式植物，其基因轉(zhuǎn)化技術(shù)成熟，常被用來進行植物逆境脅迫相關(guān) 的研宄。本發(fā)明對植物耐逆性相關(guān)蛋白編碼基因GmSTOPl進行了轉(zhuǎn)基因擬南芥及其耐鋁毒 性、耐鹽性和耐滲透脅迫的研宄，獲得的轉(zhuǎn)基因擬南芥不僅提高了對鋁毒的耐受性，還提高 了耐鹽和耐滲透脅迫的能力。qRT-PCR的結(jié)果也表明，大豆GmSTOPl響應鋁毒、高鹽和高滲 透壓的誘導，其表達水平顯著上調(diào)。由此可見將植物耐逆性相關(guān)蛋白編碼基因GmSTOPl通 過基因工程手段轉(zhuǎn)入農(nóng)作物，能夠獲得不僅耐鋁毒，還具有耐鹽和耐滲透脅迫的轉(zhuǎn)基因植 物新品種。
【附圖說明】
[0012] 圖1 GmSTOPl基因的RT-PCR擴增圖。
[0013] 圖2 GmSTOPl蛋白的亞細胞定位。
[0014] A圖為GmSTOPl融合蛋白在擬南芥原生質(zhì)體中的亞細胞定位。標尺為20 ym。
[0015] B圖為GmSTOPl融合蛋白在洋蔥表皮細胞中的亞細胞定位。標尺為100 ym。
[0016] 圖3 GmSTOPl基因在大豆品種"科豐1號"不同組織中的相對表達量。
[0017] R、SAM、S、L、F、P、SE分別代表根、莖尖分生組織、莖、葉、花、莢、種子。誤差線表示 3次重復的標準誤。
[0018] 圖4 GmSTOPl基因在AlCl3、ABA、NaCl和PEG處理下的相對表達量。
[0019] AlCl3、ABA、NaCl 和 PEG 處理濃度分別是 25ymol ?L'lOOymol ?L'200mmol .I71 和20% (m/v)。誤差線表示3次重復的標準誤。
[0020] 圖 5 pCAMBIA1301-GmST0Pl 載體圖。
[0021] 圖 6 35S: :GmST0Pl 插入 pCAMBIA1301 的酶切鑒定。
[0022] 圖7純合1~3代GmSTOPl過表達轉(zhuǎn)基因擬南芥PCR檢測結(jié)果。
[0023] 圖8不同培養(yǎng)基上擬南芥的根生長情況。
[0024] A1C13(鋁毒）處理濃度為15 ymol ? L'Col-O為野生型擬南芥，#1和#2分別代 表純合^代GmSTOPl過表達轉(zhuǎn)基因株系GmST0Pl-l和GmST0Pl-2 ;圖片拍攝于萌發(fā)15d時。
[0025] 圖9轉(zhuǎn)基因擬南芥株系和野生型的根長。
[0026] Col-0為野生型擬南芥，GmST0Pl-l和GmST0Pl-2為純合^代GmSTOPl過表達轉(zhuǎn) 基因株系；根長測量于萌發(fā)15d時。誤差線表示2次重復的標準誤。相同的小寫字母表示 它們在最短顯著極差法（shortest significant ranges, SSR)測驗中5%水平上不存在顯 著性差異，標有不同的字母表示它們在5 %水平上存在顯著性差異。
[0027] 圖10轉(zhuǎn)基因擬南芥株系和野生型的根相對生長量（RRG)
[0028] Col-0為野生型擬南芥，GmSTOPl-1和GmST0Pl-2為純合^代GmSTOPl過表達轉(zhuǎn) 基因株系。萌發(fā)15d后計算相對根生長量（RRG)。RRG(%) = (RLTt-RLjARLa-RLc。)，其 中RLTOR表擬南芥在移入酸性pH4. 3培養(yǎng)基或A1 3+處理培養(yǎng)基上生長之前的根長，RL "代 表擬南芥在酸性PH4. 3培養(yǎng)基或Al3+處理培養(yǎng)基上生長之后的根長；RL ^代表擬南芥轉(zhuǎn)移 之前的根長，RLet代表在擬南芥對在pH5. 8對照培養(yǎng)或酸性pH4. 3培養(yǎng)基上生長之后的根 長。每個株系處理10株苗，重復2次。誤差線表示2次重復的標準誤。相同的小寫字母表 示它們在最短顯著極差法測驗中5%水平上不存在顯著性差異，標有不同的字母表示它們 在5%水平上存在顯著性差異。
[0029] 圖11 NaCl處理下GmSTOPl轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型在幼苗期的表型。
[0030] Col-0為野生型擬南芥，GmSTOPl-1和GmST0Pl-2為純合^代GmSTOPl過表達轉(zhuǎn) 基因株系，野生型和轉(zhuǎn)基因株系在含有0、50、100和150mmol ?PNaCl的1/2MS培養(yǎng)基上垂 直生長10d后統(tǒng)計主根長度。左圖為代表性植物的表型圖片，右圖數(shù)值為二次獨立實驗數(shù) 據(jù)的平均值。誤差線表示2次重復的標準誤。相同的小寫字母表示它們在最短顯著極差法 測驗中5%水平上不存在顯著性差異，標有不同的字母表示它們在5%水平上存在顯著性 差異。
[0031] 圖12甘露醇處理下GmSTOPl轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型在幼苗期的表型。
[0032] Col-0為野生型擬南芥，GmST0Pl-l和GmST0Pl-2為純合^代GmSTOPl過表達轉(zhuǎn) 基因株系，野生型和轉(zhuǎn)基因株系在含有0、100、200和300mmol ? I71甘露醇的1/2MS培養(yǎng)基 上垂直生長l〇d后統(tǒng)計主根長度。左圖為代表性植物的表型圖片，右圖數(shù)值為二次獨立實 驗數(shù)據(jù)的平均值。誤差線表示2次重復的標準誤。相同的小寫字母表示它們在最短顯著極 差法測驗中5%水平上不存在顯著性差異，標有不同的字母表示它們在5%水平上存在顯 著性差異。
【具體實施方式】
[0033] 以下實施例中所涉及的材料和試劑：
[0034] 大豆品種為"科豐1號"、野生型擬南芥Col-0、載體pCAMBIA1301、pJIT166-GFP和 根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105均由南京農(nóng)業(yè)大學國家大豆改良中心保存。pMD19-T Vector和大 腸桿菌感受態(tài)細胞DH5 a購自寶生物工程（大連）有限公司。
[0035] T4DNA連接酶、rTaq酶、高保真酶PcimeSRAR/HS DNA Polymerase、P丨'inieScript'g: RT Master Mix Perfect Real Time試劑盒、SYBRI!Premix Ex Taq?II(Perfect Real-time)購自寶生物工程（大連）有限公司；質(zhì)粒DNA小量試劑盒、無內(nèi)毒素大提質(zhì)粒 試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自Axygen ;植物總RNA快速提取試劑盒購自天根生化科 技（北京）有限公司；限制性內(nèi)切酶購自NEB(北京）。氨芐青霉素（Ampicillin)、卡那霉 素（Kanamycin)、利福平（Rifampicin)均購自 Sigma。
[0036] 實施例1大豆GmSTOPl基因的克隆
[0037] 參照離心柱型植物總RNA提取試劑盒說明書提取大豆品種"科豐1號"葉片和 根的總 RNA，使用 PrimcScript?:RT Master Mix Perfect Real Time 試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄 合成cDNA。根據(jù)大豆中擬南芥AtSTOPl同源基因Glymal6g27280的cDNA序列設計引物 GmSTOPl-F和GmSTOPl-R，以鋁脅迫處理6h的RNA反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，用高保真酶進 行基因擴增。將目的條帶進行切膠回收，連接PMD19-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細 胞，隨機挑取10個單菌落進行擴大培養(yǎng)，參照質(zhì)粒DNA小量試劑盒說明書提取質(zhì)粒后進行 PCR鑒定，陽性克隆送至上海英濰捷基生物技術(shù)公司測序。
[0038]
【主權(quán)項】
1. 植物耐逆性相關(guān)蛋白GmSTOPl在培育耐鋁毒、耐鹽和耐滲透脅迫的大豆品種中的應 用，所述的植物耐逆性相關(guān)蛋白GmSTOPl氨基酸序列如SEQIDNO. 13所示。
2. 編碼植物耐逆性相關(guān)蛋白GmSTOPl的基因在培育耐鋁毒、耐鹽和耐滲透脅迫的大 豆品種中的應用，所述的編碼植物耐逆性相關(guān)蛋白GmSTOPl的基因核苷酸序列如SEQID NO. 14所示。
3. 含有編碼植物耐逆性相關(guān)蛋白GmSTOPl的基因的重組表達載體在培育耐鋁毒、耐鹽 和耐滲透脅迫的大豆品種中的應用，所述的編碼植物耐逆性相關(guān)蛋白GmSTOPl的基因核苷 酸序列如SEQIDNO. 14所示。
【專利摘要】本發(fā)明公開了植物耐逆性相關(guān)蛋白GmSTOP1及其編碼基因的應用。植物耐逆性相關(guān)蛋白GmSTOP1及其編碼基因能夠在培育耐鋁毒、耐鹽和耐滲透脅迫的大豆品種中的應用，所述的植物耐逆性相關(guān)蛋白GmSTOP1氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示，所述的編碼植物耐逆性相關(guān)蛋白GmSTOP1的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。將植物耐逆性相關(guān)蛋白編碼基因GmSTOP1通過基因工程手段轉(zhuǎn)入農(nóng)作物，能夠獲得不僅耐鋁毒，還具有耐鹽和耐滲透脅迫的轉(zhuǎn)基因植物新品種。
【IPC分類】A01H5-00, C12N15-82, C12N15-29, C07K14-415
【公開號】CN104844702
【申請?zhí)枴緾N201510234713
【發(fā)明人】李艷, 蓋鈞鎰, 叢亞輝, 帥琴, 王寧
【申請人】南京農(nóng)業(yè)大學
【公開日】2015年8月19日
【申請日】2015年5月8日