定向固定化pega復合型樹酯的制備方法及應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是含有06-烷基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT) 的重組蛋白固定于固體材料表面，以建立MGMT重組蛋白固定化方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 以固定化蛋白質(zhì)為核心的酶反應器、生物傳感器、生物芯片等技術(shù)對于生物催化、 蛋白質(zhì)組學、臨床診斷和新藥開發(fā)具有重要意義。固定化后蛋白質(zhì)生物活性強弱是成功構(gòu) 建上述固定化蛋白質(zhì)界面的前提和決定因素，也是影響后期催化、識別、診斷和篩選等結(jié)果 最為關(guān)鍵的因素。因此，蛋白質(zhì)的高活性固定化方法學研宄不僅能提高上述技術(shù)研宄結(jié)果 的準確性，而且對揭示生命科學領(lǐng)域蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-小分子藥物相互作用機制、 理解信號傳導過程具有重要意義。
[0003] 目前，將蛋白質(zhì)固定在固體材料表面的方法一般可分為物理吸附法和化學鍵合 法。物理吸附法簡便，易于操作，且蛋白質(zhì)的固載量大。然而，由于所用方法無特異性，且蛋 白質(zhì)與固體材料間作用較弱，該方法所得固定化蛋白質(zhì)在使用過程中蛋白質(zhì)易于流失，從 而也影響了研宄結(jié)果的準確性。化學鍵合方法中又可分為隨意固定化和定向固定化，隨意 固定化方法一般利用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的氨基、羧基和巰基等基團，與固體材料表面修飾的醛 基等發(fā)生化學反應，通過共價鍵將蛋白質(zhì)隨意固定在固體表面，此類方法由于固定過程中 蛋白質(zhì)在固體表面取向和構(gòu)象不一，容易使其活性位點受到影響。而定向固定化方法可很 好地解決這類問題，可以使蛋白質(zhì)在固體表面的取向和構(gòu)象達到統(tǒng)一。本專利就是一種定 向固定化方法，由于重組蛋白中的MGMT標簽在重組蛋白質(zhì)上的位置是固定的，一般位于目 標蛋白的N末端、C末端或其兩端，因此，不會影響目的蛋白本身的構(gòu)象和活性位點。本專 利旨在建立一種高選擇性的MGMT標簽融合蛋白的固定化新方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供定向固定化PEGA復合型樹酯的制備方法及應用。
[0005] 本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0006] 定向固定化PEGA復合型樹酯的制備方法，包括以下步驟：
[0007] a、將2-氨基-6-氯嘌呤（化合物A)和4-硝基芐醇（化合物B)加入溶劑中，在 一定溫度和堿性條件下發(fā)生Williamson成醚反應，生成4-硝基-芐基鳥嘌呤；如下反應式 所示：
[0008]
【主權(quán)項】
1. 定向固定化PEGA復合型樹醋的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： a、 將2-氨基-6-氯嘌呤和4-硝基芐醇加入溶劑中，在一定溫度和堿性條件下發(fā)生 Williamson成醚反應，生成4-硝基-芐基鳥嗓呤； b、 將4-硝基-芐基鳥嘌呤經(jīng)叔丁氧羰基保護，在鈀碳催化下常壓加氫，溶劑為四氫呋 喃，在4-二甲氨基吡啶存在的條件下，加入二碳酸二叔丁酯，攪拌還原生成化合物（3); c、 攪拌還原生成化合物（3)，芐氧羰基氯保護的Y-氨基丁酸在乙基二甲基碳二亞胺 和1-羥基苯并三氮唑的存在下，發(fā)生偶合反應，生成化合物（5); d、 發(fā)生偶合反應生成的化合物（5)經(jīng)鈀碳加氫還原、分離純化后，在二氯乙烷、1-羥基 苯并三唑的存在下，與表面富含羧基的PEGA反應，并在二氯甲烷、三氟乙酸的作用下，其反 應的摩爾比為1:1~1. 5酸性條件下，脫保護即得芐基鳥嘌呤衍生物修飾的PEGA樹酯（8); e、 含06-烷基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶標簽一類蛋白質(zhì)與芐基鳥嘌呤修飾的樹酯直 接混合后，即可發(fā)生高效的烷基轉(zhuǎn)移反應，將以硫醚共價鍵的形式定向固定在PEGA樹酯表 面。
2. 如權(quán)利要求1所述的定向固定化PEGA復合型樹醋的制備方法，其特征在于，步驟a 中的溶劑為甲醇、乙醇、異丙醇中的一種或其中任意組合，反應底物摩爾比為1: 1，反應溫度 為80°C，加熱回流時間為0. 5~24小時之間。
3. 如權(quán)利要求1所述的定向固定化PEGA復合型樹醋的制備方法，其特征在于，步驟b 中鈀碳用量為反應原料用量的5%，反應溫度為25°C，攪拌時間為5~8小時。
4. 如權(quán)利要求1所述的定向固定化PEGA復合型樹醋的制備方法，其特征在于，所述步 驟c經(jīng)芐氧羰基保護的反應條件為：NaOH水溶液，室溫反應14小時后可得反應產(chǎn)物（4)。 發(fā)生偶合反應的條件為：加入乙基二甲基碳二亞胺反應0. 5小時之后，加入1-羥基苯并三 氮唑，攪拌反應2小時可得反應產(chǎn)物（5)。
5. 如權(quán)利要求1所述的定向固定化PEGA復合型樹醋的制備方法，其特征在于，所述步 驟e中06-烷基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶標簽一類蛋白質(zhì)為a-型受體、0 -型受體、M-型受 體、N-型受體、血管緊張素受體AT的任一種。
6. 如權(quán)利要求1-5任一所述的定向固定化PEGA復合型樹酯的制備方法方法制得的定 向固定化PEGA復合型樹酯。
7. 如權(quán)利要求6所述的定向固定化PEGA復合型樹醋，其特征在于，定向固定化PEGA復 合型樹酯應用于制備具有特異性識別作用的試劑診斷盒。
【專利摘要】本發(fā)明公開了定向固定化PEGA復合型樹酯的制備方法及應用，以2-氨基-6-氯嘌呤和4-硝基芐醇為原料，發(fā)生Williamson成醚反應，合成4-硝基-芐基鳥嘌呤，經(jīng)叔丁氧羰基保護還原，與芐氧羰基氯保護的γ-氨基丁酸在乙基二甲基碳二亞胺和1-羥基苯并三氮唑的存在下，發(fā)生偶合反應。經(jīng)還原、分離純化，與PEGA反應，脫保護即得芐基鳥嘌呤衍生物修飾的PEGA樹酯，與含MGMT標簽的一類蛋白質(zhì)發(fā)生烷基轉(zhuǎn)移反應，將以硫醚共價鍵的形式定向固定在PEGA樹酯表面。該方法反應穩(wěn)定、步驟簡單，制備的產(chǎn)物可在固體材料表面形成穩(wěn)定、均勻、取向統(tǒng)一的蛋白質(zhì)涂層，用于制備具有特異性識別作用的試劑診斷盒。
【IPC分類】C07K17-08
【公開號】CN104844710
【申請?zhí)枴緾N201510175637
【發(fā)明人】趙新鋒, 鄭曉暉, 張亞軍, 肖超妮, 王靜
【申請人】西北大學
【公開日】2015年8月19日
【申請日】2015年4月13日