擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因ugt73c7在提高植物抗病性中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一個糖基轉(zhuǎn)移酶基因的應(yīng)用，尤其涉及一種擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因 UGI73C7在提高植物抗病性中的應(yīng)用，屬于基因工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 自然界中的致病菌（活體型菌、半活體型菌、死體型菌）無處不在，它們通過各自 不同的途徑（如通過表皮細(xì)胞的氣孔、水孔或受傷的部位）進(jìn)入植物體內(nèi)，寄宿在植物體內(nèi) 的不同部位（細(xì)胞間或穿過細(xì)胞質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)）（Jones at el.，2006)。寄宿在植物體內(nèi) 的植物病原菌大量增殖，引起植物嚴(yán)重的病害。
[0003] 在農(nóng)業(yè)上，植物病害一直是生產(chǎn)中難以防治的，據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FA0)估計，全 世界糧食生產(chǎn)每年因病害的發(fā)生而導(dǎo)致的損失占總損失的10%，嚴(yán)重時，甚至導(dǎo)致絕收。 瓜果蔬菜也常常遭受病原菌的危害，例如甘藍(lán)枯萎病，甘藍(lán)枯萎病最早發(fā)現(xiàn)于美國（Smith， 1899)，它是由尖抱鏡刀菌粘團(tuán)?；停‵usarium oxysporumf.sp.Conglutinans，F(xiàn)0C699) 引起的土傳病害，近年來，在我國北方甘藍(lán)產(chǎn)區(qū)出現(xiàn)了由尖孢鐮刀菌引起的枯萎病，導(dǎo)致部 分地區(qū)甘藍(lán)嚴(yán)重減產(chǎn)。甘藍(lán)枯萎病是一種典型的土傳病害，難以通過藥劑等措施來防治，其 發(fā)病區(qū)域呈逐年擴(kuò)大的趨勢（李明遠(yuǎn)等，2003)。再例如白菜病毒病、霜霉病和軟腐病在我 國白菜種植過程中經(jīng)常發(fā)生，一般導(dǎo)致白菜品質(zhì)下降、產(chǎn)量降低甚至絕收，而這些病害用傳 統(tǒng)的方法不易防治，并且會引起農(nóng)藥殘留，影響蔬菜品質(zhì)。利用基因工程技術(shù)，獲得具有植 物病原菌抗性的白菜、甘藍(lán)等十字花科蔬菜可以有效緩解作物的病害。
[0004] 糖基轉(zhuǎn)移酶是專門負(fù)責(zé)催化糖基化修飾反應(yīng)的酶類，擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶家族1中 共有119個可能的糖基轉(zhuǎn)移酶。雖然這些糖基轉(zhuǎn)移酶基因的序列已公開于核酸序列數(shù)據(jù) 庫中，但是這些糖基轉(zhuǎn)移酶基因的特殊功能還遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有被揭示，如擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶家族1 中的UGI73C7基因能夠增強轉(zhuǎn)基因植物抗病性的功能和應(yīng)用目前未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供了 一種擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因 UGI73C7在提高植物抗病性中的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明所述擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGI73C7在提高植物抗病性中的應(yīng)用。
[0007] 其中：所述糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGI73C7的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示；所述抗病 是指對病原菌PstDC3000或F0C699的抗性。所述植物優(yōu)選是十字花科植物，所述十字花科 植物優(yōu)選是擬南芥、油菜、白菜、甘藍(lán)或芥菜。
[0008] 本發(fā)明利用SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的引物序列，通過RT-PCR技術(shù)從擬 南芥中克隆糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGI73C7,然后利用該基因構(gòu)建植物過表達(dá)載體，進(jìn)行植物轉(zhuǎn)基 因操作，獲得轉(zhuǎn)基因植物。檢測表明轉(zhuǎn)基因植物的抗病性（如對病原菌PstDC3000或F0C699 的抗性）得到顯著提高（見圖1、圖2、圖3、圖4和圖5)。
[0009] 本發(fā)明實施后可能帶來的有益效果
[0010] 實驗證實，應(yīng)用本發(fā)明所述擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGI73C7進(jìn)行植物轉(zhuǎn)基因操 作，可以顯著提高轉(zhuǎn)基因植物的抗病性。預(yù)示本發(fā)明實施后將會創(chuàng)造新型抗病植物，可用于 后續(xù)的作物品種改良，植物新品種開發(fā)生產(chǎn)，對我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重大意義。
【附圖說明】
[0011] 圖1. UGI73C7轉(zhuǎn)基因植物成苗期對病原菌PstDC3000的抗性明顯增強（證據(jù)之 一）。
[0012] 其中WT為擬南芥對照植物，UGI73C70E-1和UGI73C70E-2為UGI73C7兩個轉(zhuǎn)基因 過表達(dá)株系。A為PstDC3000侵染三天后，整株植物圖片；B為PstDC3000侵染后，蓮座葉圖 片。成苗接種病原菌三天后，野生型葉片壞死斑明顯大于UGI73C7過表達(dá)體。
[0013] 圖2. UGI73C7轉(zhuǎn)基因植物幼苗期對病原菌PstDC3000的抗性明顯增強（證據(jù)之 二）。
[0014] 其中WT為擬南芥對照植物，UGI73C70E-1和UGI73C70E-2為UGI73C7兩個轉(zhuǎn)基因 過表達(dá)株系。UGI73C7過表達(dá)體幼苗中PstDC3000的增長量明顯少于野生型。
[0015] 圖3. UGI73C7轉(zhuǎn)基因植物對病原菌FOC699的抗性明顯增強（證據(jù)之三）。
[0016] 其中WT為擬南芥對照植物，UGI73C70E-1和UGI73C70E-2為UGI73C7兩個轉(zhuǎn)基因 過表達(dá)株系。A為植株在浸染FOC69912h、24h后下胚軸熒光強度；B為浸染FOC69912h后， 利用RealtimePCR統(tǒng)計的各株系中FOC699的生物量結(jié)果。UGI73C7過表達(dá)體中FOC699的 增長量明顯少于野生型。
[0017] 圖4. UGI73C7轉(zhuǎn)基因過表達(dá)體中免疫相關(guān)基因的表達(dá)分析（證據(jù)之四）。
[0018] 其中WT為擬南芥對照植物，UGI73C70E-1和UGI73C70E-2為UGI73C7兩個轉(zhuǎn)基因 過表達(dá)株系。A為兩個抗病基因（SNC1、RPP4)的表達(dá)量驗證結(jié)果；B為兩個參與植物免疫 的病程相關(guān)蛋白基因（PR1)和（PR2)的表達(dá)量檢測；C為抗病信號通路上的兩個基因PAD4 和EDS1以及水楊酸運輸相關(guān)蛋白基因（EDS5)的表達(dá)量檢測。其中WT為擬南芥對照植物， UGI73C70E-1和UGI73C70E-2為UGI73C7兩個轉(zhuǎn)基因過表達(dá)株系。UGI73C7過表達(dá)體中免 疫相關(guān)基因的表達(dá)相對野生型明顯上調(diào)。
[0019] 圖5. UGI73C7轉(zhuǎn)基因過表達(dá)體中水楊酸（SA)的含量明顯增加（證據(jù)之五）。
[0020] 其中WT為擬南芥對照植物，UGI73C70E-1和UGI73C70E-2為UGI73C7兩個轉(zhuǎn)基因 過表達(dá)株系。A為總SA含量檢測的高效液相色譜圖；B為植物體內(nèi)自由態(tài)SA的累積量；C 為植物體內(nèi)總SA的累積量。UGI73C7過表達(dá)體中SA的累積量明顯高于野生型，說明抗病 增強。
【具體實施方式】
[0021] 實施例1克隆擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGI73C7
[0022] 1.擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGI73C7的克隆
[0023] 通過公開網(wǎng)站http://www. cazy. org獲得UGT73C7基因的cDNA序列。根據(jù)cDNA 序列設(shè)計引物，正向引物為 73C7-F: 5 ' -GGATCCCTTCTACAATGTGTTCTCATGATCC-3 '，反向引物 為 73C7-R:5'-GAGCTCGITITTCTCTGGTGCCAAATACC-3'。利用 TRIzol 試劑盒提取擬南芥 RNA， RT-PCR方法擴(kuò)增UGI73C7基因的全長cDNA序列。將cDNA克隆的過程是先經(jīng)過BamHI和 Sac I酶切，之后連入相應(yīng)酶切的pBluescript II SK(+)載體中，構(gòu)建成測序中間載體，稱 為PK73C7。然后對載體進(jìn)行目標(biāo)基因的PCR擴(kuò)增和BamHI和Sac I酶切驗證，最后進(jìn)行序 列測定，驗證克隆基因序列的正確性。
[0024] 2.擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGI73C7的序列信息與特性分析
[0025] UGI73C7基因的編碼區(qū)cDNA為1473bp，編碼490個氨基酸的54. 5kDa蛋白，C端 具有44個氨基酸的PSPG盒，為植物次生代謝物糖基轉(zhuǎn)移酶所共同具有的保守序列。
[0026] 實施例2擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGI73C7的轉(zhuǎn)基因應(yīng)用
[0027] 1.含有UGI73C7編碼區(qū)cDNA表達(dá)載體的構(gòu)建
[0028] pK73C7中間測序載體經(jīng)過BamHI和Sac I雙酶切后，獲得帶有酶切粘性末端的全 長cDNA序列。將此基因片段與用相應(yīng)酶酶切后的pBI121載體部分相連，得到以CaMV 35S 啟動子驅(qū)動糖基轉(zhuǎn)移酶基因過表達(dá)的植物表達(dá)載體，稱為PBI73C7。
[0029] 2.農(nóng)桿菌介導(dǎo)植物轉(zhuǎn)化
[0030] 農(nóng)桿菌GV3101具有侵染植物和轉(zhuǎn)移基因的能力，故將構(gòu)建的UGI73C7植物表達(dá)載 體（PBI73C7)轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，然后進(jìn)行PCR驗證和酶切驗證。利用浸花法（一種公開的通用 方法），使含有植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌GV3101浸染擬南芥花蕾。待其長出的角果成熟之后， 收集T1代種子并在篩選培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基附加30mg/L卡那霉素）上進(jìn)行篩選，將能夠正 常生長的綠色轉(zhuǎn)化苗移栽至營養(yǎng)土中培養(yǎng)，分別收獲其T2代種子再進(jìn)行下一輪的卡那霉 素篩選，挑選出綠苗：白苗為3 :1的培養(yǎng)皿。將此培養(yǎng)皿上的綠苗移栽，單株收獲種子（T3 代）。對每一單株的種子部分用于卡那霉素平皿篩選，直到選出在篩選培養(yǎng)基上為全綠的株 系，即為純合轉(zhuǎn)基因株系。
[0031] 3.轉(zhuǎn)基因植株分子鑒定
[0032] 對上述轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行基因表達(dá)水平的檢測。分別提取轉(zhuǎn)基因植株和野生型 植株的RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，分析過表達(dá)植株和野生型植株的基因表達(dá)差異。 UGI73C7在過表達(dá)植株中的表達(dá)量都明顯高于野生型植株。利用兩個UGI73C7表達(dá)量高的 株系，即UGI73C70E-1和UGI73C70E-2,來進(jìn)行后續(xù)的工作。
[0033] 4. UGI73C7基因的抗病性功能驗證
[0034] (1)UGI73C7轉(zhuǎn)基因植物抗病性增強的證據(jù)之一。
[0035] UGI73C7轉(zhuǎn)基因過表達(dá)體成苗期對病原菌PstDC3000的抗性實驗。
[0036] 將受試植物在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)到第4周，在超凈工作臺中，用無菌棉棒在植物葉表 面均勻涂抹濃度為1 x 107個/ml病原菌PstDC3000,三天后觀察植株葉片變化。發(fā)現(xiàn)野生 型的擬南芥葉片出現(xiàn)較大的壞死斑點，而UGT73C70E轉(zhuǎn)基因葉片未出現(xiàn)或出現(xiàn)很小的壞死 斑點（圖1)，說明UGI73C70E轉(zhuǎn)基因植株成苗對植物病原菌PstDC3000的抗性明顯增強。
[0037] (2)UGI73C7轉(zhuǎn)基因植物抗病性增強的證據(jù)之二。
[0038] UGI73C7轉(zhuǎn)基因過表達(dá)體幼苗對病原菌PstDC3000的抗性檢測實驗。
[0039] 在22°C條件下，將受試植物培養(yǎng)到2周，分別取WT，UGI73C70E-1，UGI73C70E-2 幼苗浸沒到濃度為1X10 7個/ml PstDC3000中l(wèi)h，浸沒lh后取出。取出的材料分為兩部 分，一部分用于統(tǒng)計菌體的初始數(shù)量，即每個株系分別取三棵幼苗立刻放入離心管中，稱量 每個離心管中三棵幼苗的重量，充分研磨，稀釋到一定倍數(shù)，涂布到含有利福平和卡那霉素 的KB固體培養(yǎng)基上，每組3個平行，培養(yǎng)3d后，統(tǒng)計每個平板上菌落數(shù)量，然后統(tǒng)計出的菌 落數(shù)目除以對應(yīng)幼苗的重量，為每毫克幼苗中初始病原菌數(shù)。另一部分放置在墊有濕濾紙 的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，三天后利用上述同樣的方法統(tǒng)計每毫克幼苗中最終病原菌菌落數(shù)。分別 用最終病原菌菌落數(shù)的Log值減去初始病原菌菌落數(shù)的Log值，得到的數(shù)值即為植物病原 菌的增長量。如圖2中所示，UGI73C70E轉(zhuǎn)基因植株中病原菌數(shù)量的增長明顯變慢，說明 UGI73C70E轉(zhuǎn)基因植株獲得了對病原菌PstDC3000的明顯抗性。
[0040] KB培養(yǎng)基：
[0041]
【主權(quán)項】
1. 擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGI73C7在提高植物抗病性中的應(yīng)用。
2. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于：所述糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGI73C7的核苷酸序 列如SEQ ID No. 1所示；所述抗病是指對病原菌PstDC3000或F0C699的抗性。
3. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于：所述植物是十字花科植物。
4. 如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于：所述十字花科植物是擬南芥、油菜、白菜、甘 藍(lán)或芥菜。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGT73C7在提高植物抗病性中的應(yīng)用，其中所述糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGT73C7的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其是通過RT-PCR技術(shù)從擬南芥中克隆的。本發(fā)明利用基因UGT73C7構(gòu)建植物過表達(dá)載體，進(jìn)行植物轉(zhuǎn)基因操作，獲得轉(zhuǎn)基因植物。檢測表明轉(zhuǎn)基因植物的抗病性得到顯著提高，預(yù)示本發(fā)明實施后將會創(chuàng)造新型抗病植物，可用于后續(xù)的作物品種改良，對我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重大意義。
【IPC分類】C12N15-54, A01H5-00, C12N15-84
【公開號】CN104845990
【申請?zhí)枴緾N201510319793
【發(fā)明人】侯丙凱, 王勇, 李燕潔
【申請人】山東大學(xué)
【公開日】2015年8月19日
【申請日】2015年6月11日