一種用于男性無(wú)精癥診斷的試劑盒和使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)療檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于男性無(wú)精癥診斷的試劑盒和使 用方法。
【背景技術(shù)】
[0002]多年來(lái)，傳統(tǒng)的精液常規(guī)分析一直是用于判斷男性生育力的最基本臨床指標(biāo)。臨 床上對(duì)絕大部分的男性不育患者的真正不育原因仍然不清楚。尤其是臨床上大約有三分之 一不育患者，男性的常規(guī)精液分析結(jié)果均正常和接近正常。臨床上把這類患者劃為不明原 因不育癥。因此，長(zhǎng)期以來(lái)，臨床對(duì)男性不育的診斷存在很大的困難。
[0003] 傳統(tǒng)的男性不育的診斷方法是利用精子的活力分析，精子計(jì)數(shù)等方法，而這類方 法具有如下的特點(diǎn)： 1、 精子計(jì)數(shù)受到外界的影響因素較多，如吸煙、飲酒等都會(huì)造成結(jié)果的波動(dòng)較大； 2、 精子的活力分析需要昂貴的儀器分析，且與受試者是否近期有同房等因素有顯著相 關(guān)； 3、 目前的方法都是基于精液的檢測(cè)方法，收集樣本的過(guò)程較為繁瑣。
[0004] 而采用血漿的分子標(biāo)記物的檢測(cè)方法具有采樣簡(jiǎn)單、直接，可以直接反映病人的 生育水平的特點(diǎn)。如201310112391. 1，名稱為"男性不育的生物標(biāo)志物及其應(yīng)用"的發(fā)明專 利申請(qǐng)，檢測(cè)受試者體液中至少一種指示男性不育生物標(biāo)志物的水平，其中至少一種指示 男性不育生物標(biāo)志物選自乙酰肉堿、天冬氨酸、肉堿C3 :1、酮肉堿、亮氨酰脯氨酸、肉堿C8、 甲基黃嘌呤、肉堿C10 :2、肉堿C10 :1、腺嘌呤；所述體液選自受試者尿液、血清、血漿、血液、 精液、精子、精漿、唾液。該檢測(cè)方法需要高效液相層析分析儀等昂貴的儀器，另一方面，需 要同時(shí)檢測(cè)多個(gè)生物標(biāo)記物，且通過(guò)受試者操作曲線（R0C)，這一反映生物標(biāo)記物的經(jīng)典方 法發(fā)現(xiàn)，即使采用多個(gè)標(biāo)記物組合其曲線下面積（AUC)最高為0. 73,對(duì)應(yīng)的敏感性與特異 性僅為65 %與71%。 201310722584. 9,名稱為"一種精子細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的基因檢測(cè)方法"的發(fā)明專利申 請(qǐng)，通過(guò)抽提口腔上皮細(xì)胞樣本的基因組DNA，再經(jīng)熒光定量PCR反應(yīng)檢測(cè)分析個(gè)體的N0S3 基因、FASLG基因SNPs位點(diǎn)基因攜帶型，為所有的受檢者提供精子細(xì)胞凋亡相關(guān)基因檢測(cè)， 并結(jié)合中國(guó)人群中特有的與無(wú)精癥、少精癥相關(guān)的環(huán)境暴露因素和生活方式影響因素對(duì)男 性的不育發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)評(píng)估。該檢測(cè)方法是從基因多態(tài)的層面提取口腔上皮細(xì)胞的 DNA，進(jìn)行基因擴(kuò)增后觀察基因多態(tài)性與無(wú)精子的相關(guān)情況，從DNA的水平觀察其與無(wú)精癥 的相關(guān)情況，其DNA變異與無(wú)精癥僅為相關(guān)性研宄，沒(méi)有對(duì)檢測(cè)方法與精子產(chǎn)生等參數(shù)關(guān) 聯(lián)的具體相關(guān)性的資料，敏感性與特異性低，不具有實(shí)用性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種用于男性無(wú)精癥診斷的試劑盒和使用 方法。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種在精子發(fā)生過(guò)程中起重要作用的微小RNA (miRNA)基因miR-15b， miR-15b在男性不育病人中的表達(dá)差異，并且可以在血漿中檢測(cè)到其表達(dá)的顯著變化。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案： 一種用于男性無(wú)精癥診斷的試劑盒，其特征在于：用于測(cè)定血漿miR-15b的不同表達(dá) 水平的生物標(biāo)志物檢測(cè)試劑，通過(guò)miR-15b的過(guò)度表達(dá)提示男性無(wú)精癥。
[0007] 本發(fā)明所述 miR-15b 的基因序列為：5' -TAGCAGCACA TCATGGITTA C。
[0008] 本發(fā)明所述的試劑盒包括質(zhì)控品、反轉(zhuǎn)錄體系、PCR擴(kuò)增miRNAs的反應(yīng)體系和 miR-15b特異性引物探針。
[0009] 所述的質(zhì)控品為正常生精者的血漿miR-15b表達(dá)水平。
[0010] 所述的正常生精者的血漿中miR-15b含量大于2000萬(wàn)/毫升。
[0011] 優(yōu)選地，所述的miR-15b特異性引物探針為Taqman探針，具有高適應(yīng)性和可靠性， 實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定重復(fù)性好，特異性更高。
[0012] 本發(fā)明所述的男性不育診斷的試劑盒的使用方法，步驟如下： A、 RNA提?。翰捎醚獫{RNA抽提試劑提取血漿樣本中的RNA ; B、 熒光定量PCR :對(duì)提取到的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，取cDNA為模板，用Taqman探針 法進(jìn)行PCR反應(yīng)，檢測(cè)受試樣本與質(zhì)控品的Ct值； C、 結(jié)果判定：將檢測(cè)值采用2- AA Ct方法換算成相對(duì)表達(dá)量，以相對(duì)表達(dá)值4. 2為臨 界值，超過(guò)4. 2即推測(cè)為無(wú)精癥。
[0013] 本發(fā)明的試劑盒可用于診斷男性無(wú)精癥，推斷男性不育，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積 與PCR產(chǎn)物形成完全同步，其預(yù)測(cè)男性不育的敏感性與特異性分別為71. 4%與100%，特異性 好，定量結(jié)果準(zhǔn)確性高，具有良好的檢測(cè)效能，是測(cè)定的金標(biāo)準(zhǔn)。
[0014] 相對(duì)于傳統(tǒng)的精子活力與計(jì)數(shù)的方法相比，有如下優(yōu)點(diǎn)： 1、檢測(cè)所需的樣本量少，速度快，時(shí)間短，可用于評(píng)估精子質(zhì)量與功能的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)， 可為臨床原因不明的男性不育患者提供檢測(cè)及臨床咨詢。
[0015] 2、試劑盒的檢測(cè)對(duì)象為血漿樣本，而非從精液中分離精子樣本，是一種快速與準(zhǔn) 確的篩選男性精子發(fā)生障礙的新的方法。
[0016] 3、本試劑盒基于定量PCR的原理，結(jié)果重復(fù)性好，客觀準(zhǔn)確，易于在不同的檢測(cè)機(jī) 構(gòu)與醫(yī)院檢驗(yàn)科，男科實(shí)驗(yàn)室等推廣。
【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1為動(dòng)物模型的結(jié)果分析。
[0018] (a)構(gòu)建通過(guò)PGK2啟動(dòng)子在生精細(xì)胞特異的過(guò)表達(dá)miR-15b的轉(zhuǎn)基因小鼠。
[0019] (b ) PCR鑒定出陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因小鼠模型。
[0020] (c)miR_15b轉(zhuǎn)基因小鼠的睪丸H & E染色顯示出現(xiàn)精子發(fā)生缺陷，未成熟精子細(xì) 胞脫落。左邊為正常對(duì)照小鼠睪丸切片。
[0021] (d)附睪中收集的精子計(jì)數(shù)結(jié)果。
[0022] (e)miR_15b轉(zhuǎn)基因小鼠的曲精小管的直徑。
[0023] (f) miR-15b轉(zhuǎn)基因小鼠血漿的miR-15b表達(dá)。
[0024] (g) Western blot結(jié)果顯示miR_15b調(diào)控的下游基因Cdc25a的表達(dá)。
[0025] 圖2為男性無(wú)精癥與正常受試者經(jīng)試劑盒檢測(cè)得到的miR_15b相對(duì)表達(dá)量的分布 圖。
[0026] 圖3為本發(fā)明試劑盒對(duì)無(wú)精癥診斷的特異性和敏感性分布圖。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容作進(jìn)一步詳細(xì)的描述。
[0028] 實(shí)施例1 一種用于男性無(wú)精癥診斷的試劑盒，用于測(cè)定血漿miR_15b的不同表達(dá)水平的生物標(biāo) 志物檢測(cè)試劑，通過(guò)miR_15b的過(guò)高表達(dá)提示男性無(wú)精癥。
[0029] 實(shí)施例2 一種用于男性無(wú)精癥診斷的試劑盒，用于測(cè)定血漿miR-15b的不同表達(dá)水平的生物標(biāo) 志物檢測(cè)試劑，通過(guò)miR-15b的過(guò)高表達(dá)提示男性無(wú)精癥。
[0030] 所述的試劑盒包括質(zhì)控品、反轉(zhuǎn)錄體系、PCR擴(kuò)增miRNAs的反應(yīng)體系和miR-15b特 異性引物探針。
[0031] 實(shí)施例3 一種用于男性無(wú)精癥診斷的試劑盒，用于測(cè)定血漿miR-15b的不同表達(dá)水平的生物標(biāo) 志物檢測(cè)試劑，通過(guò)miR-15b的過(guò)高表達(dá)提示男性無(wú)精癥。
[0032] 所述的試劑盒包括質(zhì)控品、反轉(zhuǎn)錄體系、PCR擴(kuò)增miRNAs的反應(yīng)體系和miR-15b特 異性引物探針。
[0033] 所述的質(zhì)控品為正常受試者的血漿miR_15b表達(dá)水平。
[0034] 實(shí)施例4 一種用于男性無(wú)精癥診斷的試劑盒，用于測(cè)定血漿miR-15b的不同表達(dá)水平的生物標(biāo) 志物檢測(cè)試劑，通過(guò)miR-15b的過(guò)高表達(dá)提示男性無(wú)精癥。
[0035] 所述的男性無(wú)精癥診斷的試劑盒包括質(zhì)控品、反轉(zhuǎn)錄體系、PCR擴(kuò)增miRNAs的反 應(yīng)體系和miR-15b特異性引物探針。
[0036] 所述的質(zhì)控品為正常生精者的血漿miR_15b表達(dá)水平。
[0037] 所述的miR_15b特異性引物探針為Taqman探針。
[0038] 實(shí)施例5 一種用于男性無(wú)精癥診斷的試劑盒，用于測(cè)定血漿miR-15b的不同表達(dá)水平的生物標(biāo) 志物檢測(cè)試劑，通過(guò)miR-15b的過(guò)高表達(dá)提示男性無(wú)精癥。
[0039] 所述的男性無(wú)精癥診斷的試劑盒包括質(zhì)控品、反轉(zhuǎn)錄體系、PCR擴(kuò)增miRNAs的反 應(yīng)體系和miR-15b特異性引物探針。
[0040] 所述的質(zhì)控品為正常生精者的血漿miR-15b表達(dá)水平，血漿中精子含量大于2000 萬(wàn)/毫升。
[0041] 實(shí)施例6 本發(fā)明所述的男性無(wú)精癥診斷試劑盒的使用方法，步驟如下： A、 RNA提?。翰捎醚獫{RNA抽提試劑提取血漿樣本中的RNA ; B、 熒光定量PCR :對(duì)提取到的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，取cDNA為模板，用Taqman探針 法進(jìn)行PCR反應(yīng)，檢測(cè)受試樣本與質(zhì)控品的Ct值； C、 結(jié)果判定：將檢測(cè)值采用2-AACt方法換算成相對(duì)表達(dá)量。
[0042] 具體實(shí)驗(yàn)操作如下： 1、RNA提取：用含EDTA抗凝劑的采血管收集3ml全血，3000g，4 °C離心10min，收 集上層黃色半透明液體就是血漿，大約有500ul血漿，用mirVana? PARIS? Kit (Life technologies，AM1556)血漿提取試劑盒提取RNA。具體操作為： a.使用前將2X變性緩沖液37 °C放置。
[0043] b. 500ul血漿樣本加入等體積的2X變性緩沖液，在加入1ml氯仿渦旋60s， 10000g，5min，室溫放置。
[0044] c.將上清轉(zhuǎn)移到新的EP管中，加入1. 25倍體積的100%乙醇，加入過(guò)濾芯離心，棄 溶液。
[0045] d?洗液1，洗滌一次，10000g，30s。
[0046] e?洗液 2/3,洗滌兩次，10000g，30s。
[0047] f ?空氣分離。
[0048] g.加入100ul 95°C預(yù)熱的洗脫液溶解收集RNA。
[0049] 2、反轉(zhuǎn)錄：反轉(zhuǎn)錄體系采用的引物來(lái)自于反轉(zhuǎn)錄試劑盒P/N 4366596 (Life公 司，美國(guó)）。
[0050] 1)按表1順序配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系 表1
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于男性無(wú)精癥診斷的試劑盒，其特征在于：用于測(cè)定血漿miR-15b的不同表 達(dá)水平的生物標(biāo)志物檢測(cè)試劑，通過(guò)miR-15b的過(guò)度表達(dá)提示無(wú)精癥。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于男性無(wú)精癥診斷的試劑盒，其特征在于：所述的試 劑盒包括質(zhì)控品、反轉(zhuǎn)錄體系、PCR擴(kuò)增miRNAs的反應(yīng)體系和miR-15b特異性引物探針。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種用于男性無(wú)精癥診斷的試劑盒，其特征在于：所述的質(zhì) 控品為正常生精者的血漿miR-15b表達(dá)水平。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種用于男性無(wú)精癥診斷的試劑盒，其特征在于：所述的 miR_15b特異性引物探針為Taqman探針。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于男性無(wú)精癥診斷的試劑盒的使用方法，其特征在 于：步驟如下： A、 RNA提?。翰捎醚獫{RNA抽提試劑提取血漿樣本中的RNA ; B、 熒光定量PCR :對(duì)提取到的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，取cDNA為模板，用Taqman探針 法進(jìn)行PCR反應(yīng)，檢測(cè)受試樣本與質(zhì)控品的Ct值； C、 結(jié)果判定：將檢測(cè)值采用2-AACt方法換算成相對(duì)表達(dá)量。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用于男性無(wú)精癥診斷的試劑盒和使用方法。該試劑盒為用于測(cè)定血漿miR-15b的不同表達(dá)水平的生物標(biāo)志物檢測(cè)試劑，通過(guò)miR-15b的過(guò)高表達(dá)提示無(wú)精癥。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種在精子發(fā)生過(guò)程中起重要作用的微小RNA基因miR-15b，miR-15b在男性不育病人中的表達(dá)差異，并且可以在血漿中檢測(cè)到其表達(dá)的顯著變化。試劑盒基于定量PCR的原理，結(jié)果重復(fù)性好，客觀準(zhǔn)確，易于在不同的檢測(cè)機(jī)構(gòu)與醫(yī)院檢驗(yàn)科，男科實(shí)驗(yàn)室等推廣。
【IPC分類】C12Q1-68
【公開號(hào)】CN104846087
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510220417
【發(fā)明人】許文明, 陳艷, 廖惠娟, 岳煥勛, 楊明, 孫華欽
【申請(qǐng)人】四川大學(xué)華西第二醫(yī)院
【公開日】2015年8月19日
【申請(qǐng)日】2015年5月4日