一種褐飛虱vrg多肽及其多抗制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種多肽及其抗體制備方法，這種抗體主要用于天然蛋白抗原的檢測，具體說就是一種兔抗褐飛虱VgR多肽多克隆抗體的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]VgR全稱為vitellogenin receptor，為卵黃原蛋白受體，是介導(dǎo)昆蟲卵黃原蛋白胞吞作用的主要受體，它屬于低密度脂蛋白家族。VgR在卵子發(fā)生等生殖過程中發(fā)揮著重要作用。經(jīng)檢索，目前市場上褐飛虱等昆蟲VgR蛋白的抗體尚無商業(yè)化產(chǎn)品，限制了昆蟲VgR蛋白生物學(xué)功能的深入研宄。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003](I)本發(fā)明的目的在于提供一種VgR多肽，其序列為:RKGNADQSVATKSD。
[0004](2)本發(fā)明的另一目的在于提供一種特異性好、純度高、可與組織或細(xì)胞中天然VgR蛋白特異識別的VgR多肽多克隆抗體及其制備方法。
[0005](3)所述的VgR多肽多克隆抗體通過以下技術(shù)方案實現(xiàn):
步驟一:在合成所述多肽序列時，在其N端增加一個半胱氨酸，方便與載體蛋白偶聯(lián)，用多肽自動合成儀合成VgR修飾多肽，純化后與載體蛋白KLH偶聯(lián)，形成VgR修飾多肽-KLH復(fù)合蛋白；
步驟二:將乳化后的VgR修飾多肽-KLH復(fù)合蛋白在兔背部皮下注射，初次免疫后，進(jìn)行3次加強(qiáng)免疫；
步驟三:收集、分離得到含有兔抗褐飛虱VgR修飾多肽抗體的血清；
步驟四:將抗血清通過VgR多肽親和層析柱進(jìn)行肽親和純化，得到VgR多肽抗體； 步驟五:對VgR多肽抗體進(jìn)行效價檢測；
步驟六:通過免疫印跡和免疫熒光對VgR多肽抗體進(jìn)行鑒定。
【附圖說明】
[0006]圖1為Western Blot圖，圖中免疫印跡的目的條帶大小在200kDa左右，與VgR蛋白的理論分子量(215.2kDa)大小一致。
[0007]圖2為免疫熒光圖，圖中的亮處為抗體反應(yīng)的陽性信號。
【具體實施方式】
[0008]下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于解釋本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明的技術(shù)方案的前提下，對本發(fā)明所作的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易實現(xiàn)的任何改動都將落入本發(fā)明的權(quán)利要求范圍之內(nèi)。
[0009]實施例一:褐飛虱VgR序列的分析與VgR多肽的設(shè)計和合成根據(jù)GenBank上的褐飛虱VgR序列(登錄號:ADE34166)，已知褐飛虱VgR蛋白序列包含1931個氨基酸，利用DNAstar軟件中的Protean程序模塊對褐飛虱VgR蛋白特性進(jìn)行分析，得知該蛋白分子量為215198.74道爾頓，等電點為4.95，為酸性蛋白，進(jìn)一步分析該蛋白氨基酸序列的抗原性、親水性、表面可能性等特征，從中篩選到一段序列為RKGNADQSVATKSD的多肽序列適合用作抗原(1295aa — 1308aa)。為便于與載體蛋白交聯(lián)，增加多肽的免疫原性，在上述多肽的N末端增加一個半胱氨酸C，故最終待合成的多肽序列為CRKGNADQSVATKSD。多肽合成由多肽自動合成儀合成，合成的多肽用高效液相色譜儀(HPLC)檢測純度，純度為85.2%，用MS質(zhì)譜儀檢測多肽的分子量，其分子量為1579.65。
[0010]實施例二:多肽與載體蛋白交聯(lián)
采用MBS作為交聯(lián)劑將載體蛋白KLH與合成多肽進(jìn)行交聯(lián):用交聯(lián)緩沖液溶解KLH至濃度為10mg/mL ;溶解MBS于DMF為10mg/mL ;將溶解后的KLH溶液和MBS溶液按10:l(ff/W)的比例混勻，室溫激活KLH 30分鐘；用S印hadex G-25純化激活的KLH溶液；將激活的KLH溶液與多肽溶液按1:1 (W/W)混合，室溫反應(yīng)3小時；將上述反應(yīng)液在PBS中4°C下透析過夜，得到多肽-KLH復(fù)合蛋白。
[0011]實施例三:實驗動物的免疫
選取適齡的新西蘭雄兔作為免疫動物，免疫前耳部靜脈采血2-3mL，用作后續(xù)ELISA檢測的陰性對照。首次免疫時，將0.5mg的多肽-KLH復(fù)合蛋白溶于0.5mL的PBS溶液中，與等體積的弗氏完全佐劑充分混勻乳化，兔子皮下多點注射。2周后，進(jìn)行首次加強(qiáng)免疫，將0.5mg的多肽-KLH交聯(lián)復(fù)合蛋白溶于0.5mL的PBS溶液中，與等體積的弗氏不完全佐劑充分混勻乳化，皮下多點注射，此后每隔3周進(jìn)行同樣操作的加強(qiáng)免疫，前后共3次。每次加強(qiáng)免疫I周后，從兔子耳部靜脈采血微量，用間接ELISA法檢測免疫血清效價，當(dāng)效價達(dá)到1:20000以上，采用頸動脈放血的方式收集兔子血液，制備血清。
[0012]實施例四:VgR多肽親和層析柱純化抗體
將ImL活化的凝膠懸液注入層析柱，待柱內(nèi)液體流干后，加入5mL的偶聯(lián)緩沖液沖洗層析柱。用ImL偶聯(lián)緩沖液溶解合成的VgR多肽，并加入層析柱，再加入ImL的偶聯(lián)緩沖液至層析柱中，于4°C條件下旋轉(zhuǎn)混勻過夜。用SmL偶聯(lián)緩沖液沖洗層析柱，再用3mL的封閉液室溫封閉I小時，用結(jié)合緩沖液沖洗層析柱3次，直至柱內(nèi)液體流干，制備得到VgR多肽結(jié)合層析柱。向?qū)游鲋鶅?nèi)加入含有VgR抗體血清的結(jié)合緩沖液，室溫混勻I小時，用30mL沖洗緩沖液沖洗層析柱，直至流出液的A280nm吸收峰穩(wěn)定。用15mL的洗脫緩沖液洗脫層析柱，獲得純化的VgR多抗。
[0013]實施例五:間接ELISA法測定抗體的效價
將VgR修飾多肽-KLH復(fù)合物包被ELISA板，4°C下過夜包被；用5%的脫脂奶粉室溫封閉 2 小時；用 VgR抗體作不同濃度稀釋，1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000、1:128000、1:256000、1:512000,室溫2小時或4°C過夜孵育；加入辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔的二抗，室溫孵育2小時；加入TMB進(jìn)行顯色反應(yīng)，硫酸終止反應(yīng)后測定450nm波長的吸光度。當(dāng)與陰性血清的比值大于2.1時，計算抗體效價。經(jīng)檢測，純化過后的VgR抗體的效價達(dá)到1:256，OOOo
[0014]實施例六:WesternBlot分析VgR抗體的特異性
按照標(biāo)準(zhǔn)方法配制SDS-PAGE凝膠，將10 μ L蛋白濃度為5mg/ml的組織裂解液加入垂直電泳槽的上樣孔中，恒壓80V電泳，待樣品跑過濃縮膠，呈一條直線時，改換120V電壓，電泳至溴酚藍(lán)指示劑完全跑出分離膠時終止電泳，采用濕轉(zhuǎn)膜方法恒壓10V電轉(zhuǎn)90分鐘，將蛋白轉(zhuǎn)膜至NC膜。將實施例四獲得的VgR抗體作為一抗，1:500稀釋后，與上述濕轉(zhuǎn)后的NC膜在室溫下雜交2小時，然后用HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體在室溫下雜交2小時，采用DAB顯色法進(jìn)行顯色，得到免疫印跡結(jié)果。
[0015] 實施例七:免疫熒光分析VgR抗體檢測組織內(nèi)VgR蛋白的表達(dá)情況
解剖出褐飛虱的卵巢，將卵巢用4%甲醛溶液固定后，用封閉液封閉，將實施例四獲得的VgR抗體作為一抗，1:100稀釋后，4°0過夜孵育，之后再以含有071181^488標(biāo)記的羊抗兔熒光二抗作為二抗，1:50稀釋后，孵育I小時，清洗未反應(yīng)的熒光二抗，用熒光防淬滅劑覆蓋組織樣品，觀察熒光并拍照。本實施例的實驗結(jié)果表明，VgR在褐飛虱卵巢中普遍表達(dá)。
【主權(quán)項】
1.一種VgR多肽，其特征在于:氨基酸序列為RKGNADQSVATKSD。
2.一種兔抗褐飛虱VgR多肽的多抗制備方法，其特征在于:按權(quán)利要求1所述VgR多肽序列合成修飾多肽，將合成的修飾多肽與載體蛋白交聯(lián)形成復(fù)合蛋白，用復(fù)合蛋白免疫動物，取免疫動物的血制備抗血清，從血清中分離純化抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗體制備方法，其特征在于:所述修飾多肽為在權(quán)利要求1的序列尾端增加一個半胱氨酸殘基，所述載體蛋白為匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)或牛血清白蛋白(BSA)，所述修飾多肽的巰基與所述載體蛋白的氨基通過交聯(lián)劑共價交聯(lián)形成復(fù)合蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗體制備方法，其特征在于:所述復(fù)合蛋白與免疫佐劑混合乳化后，在兔背部通過皮下注射，初次免疫后，通過3次加強(qiáng)免疫，得到抗血清。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗體制備方法，其特征在于:權(quán)利要求4中得到的抗血清經(jīng)過多肽親和純化后可以從抗血清中獲得高純度的抗體。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種褐飛虱VgR多肽及其多抗的制備方法。所述的VgR多肽的氨基酸序列為：RKGNADQSVATKSD，其多克隆抗體制備步驟如下：（1）褐飛虱VgR蛋白抗原表位分析；(2)褐飛虱VgR多肽設(shè)計與合成 ；(3)合成多肽與載體蛋白交聯(lián)；(4)制備兔抗褐飛虱VgR多肽抗體；(5)收集、分離得到含有抗體的血清，純化抗體，即得到抗褐飛虱VgR多肽的抗體。本發(fā)明得到的褐飛虱VgR多肽多克隆抗體特異性好、純度高，可與褐飛虱VgR蛋白發(fā)生特異性結(jié)合發(fā)應(yīng)，可用于褐飛虱VgR蛋白的相關(guān)研究，如其特性、功能、表達(dá)譜和含量的分析。
【IPC分類】C07K14-705, C07K16-28
【公開號】CN104861059
【申請?zhí)枴緾N201510209541
【發(fā)明人】俞曉平, 許益鵬, 申屠旭萍, 劉光富, 郝培應(yīng), 楊倩倩
【申請人】中國計量學(xué)院
【公開日】2015年8月26日
【申請日】2015年4月29日