一種豬脂肪細(xì)胞外基質(zhì)的提取工藝的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)和生物材料技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種豬的脂肪細(xì)胞外基質(zhì)的提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002]注射用填充材料在臨床中可用于治療面部凹陷、畸形，可用于改變患者的外形從而滿足更高的審美要求，目前在臨床中使用較多的注射用填充材料有透明質(zhì)酸、膠原蛋白等，然而它們具有易于被吸收，生物活性差等缺陷。細(xì)胞外基質(zhì)是由動物細(xì)胞合成并分泌到細(xì)胞外，分布在細(xì)胞表面或細(xì)胞間的大分子，主要是一些多糖和蛋白或蛋白聚糖。細(xì)胞外基質(zhì)不僅為細(xì)胞提供了一個支持結(jié)構(gòu)和附著位點，而且通過與細(xì)胞的粘附分子、生長調(diào)節(jié)因子、結(jié)合蛋白、蛋白水解酶以及酶抑制劑相互作用，而對細(xì)胞的粘附、迀移、增殖、分化以及基因表達(dá)的調(diào)控發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。由于細(xì)胞外基質(zhì)具有以上生物活性作用，具有與天然組織器官相似的三維空間結(jié)構(gòu)，其作為支架材料被廣泛應(yīng)用于組織工程中。目前已被成功提取細(xì)胞外基質(zhì)的組織器官包括小腸粘膜、心臟瓣膜、血管、皮膚、神經(jīng)、骨骼肌、胎盤、膀胱和肝臟。脂肪的來源廣，可以從脂肪中提取到豐富的細(xì)胞外基質(zhì)，研宄證明外基質(zhì)作為生物材料能夠促進(jìn)多種組織再生。
[0003]目前被用作注射用填充材料的脂肪外基質(zhì)主要是提取自抽脂患者的脂肪，凍干后的外基質(zhì)被制備成粉末狀，可以通過20ml注射器針頭，從而達(dá)到注射用填充材料的效果。脂肪外基質(zhì)粉末具有多孔樣結(jié)構(gòu)、表面積大、顆粒體積和形狀具有高度的多樣性，有利于細(xì)胞的粘附、增殖和迀移，在脂肪外基質(zhì)和脂肪干細(xì)胞聯(lián)合注射的實驗中觀察到，脂肪干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化，同時周圍組織血管和脂肪大量形成。目前文獻(xiàn)報道(察鵬飛，高建華，陳陽等，人脂肪組織細(xì)胞外基質(zhì)支架的構(gòu)建，中華整形外科雜志，2012，28 (I)，55-60)的脂肪抽吸術(shù)獲取的脂肪提取外基質(zhì)的方法如下:收集同一患者脂肪組織約300ml，蒸餾水充分洗滌，將膨脹液及血液成分洗滌干凈，低速離心機1000r/min離心3min，去除上層的游離脂滴及下層的水分，收集純脂肪組織約100ml。共重復(fù)7次。向收集的脂肪組織中按脂肪:水分=2:1的比例加入50ml蒸餾水，轉(zhuǎn)移至勻漿機，10000-12000r/min勻漿3min，將勻漿后的混合物3000r/min離心5min。去除上層的游離脂滴及中層的蒸餾水，底層乳白色沉淀物為ECM。加入同等體積的蒸餾水洗滌3-5次，將脂滴去除干凈。收集ECMj^ 10ml，去除上層的水分。
[0004]目前技術(shù)存在的不足:(1)選用人的脂肪提取外基質(zhì)，來源較少，不易批量生產(chǎn)，不易形成產(chǎn)業(yè)化；(2)運用人的脂肪外基質(zhì)進(jìn)行自體移植時，患者需要先進(jìn)行抽脂手術(shù)，之后需要等待外基質(zhì)的提取，再進(jìn)行二次手術(shù)，增加了患者的痛苦和并發(fā)癥發(fā)生的風(fēng)險，并且體脂少或惡病質(zhì)的患者抽脂手術(shù)不能順利進(jìn)行，無法獲取足夠的材料進(jìn)行外基質(zhì)的提取，從而限制了該技術(shù)的應(yīng)用；(3)運用人的脂肪外基質(zhì)進(jìn)行異體移植時，涉及到了倫理問題，同樣面臨著脂肪來源少的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于為克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，采用豬脂肪作為原材料并提供一種新的細(xì)胞外基質(zhì)提取工藝。
[0006]本發(fā)明采用以下技術(shù)方案實現(xiàn)上述目的:一種豬脂肪外基質(zhì)提取方法，包括如下步驟:
[0007](I)將新鮮豬脂肪剪碎后用蒸餾水反復(fù)洗滌5-7次，直到洗去脂肪中混合的血液成分，將干凈的脂肪碎塊擠壓成漿糊狀，置入燒杯中稱量體積；
[0008](2)將漿糊狀的脂肪放入勻漿機中，并向勻漿機中加入等體積的蒸餾水，勻漿，勻漿機轉(zhuǎn)速為12000rpm，在室溫常壓下勻漿5min ；
[0009](3)將勻漿后的組織懸液置于震蕩搖床中震蕩，可觀察到白色脂肪與粘稠凝膠樣物質(zhì)逐漸分離，棄去上層脂肪與中層液體，加入等量蒸餾水，重復(fù)以上操作，直到全部脂肪分離出凝膠樣物質(zhì)；
[0010](4)將獲取的凝膠樣物質(zhì)分裝入50ml離心管中，向各個離心管中加入適量蒸餾水，置入離心機中離心，轉(zhuǎn)速為lOOOrpm，在室溫常壓下離心3min，離心后棄上層液體，重復(fù)3次，最終獲得的凝膠樣沉淀即為豬的脂肪細(xì)胞外基質(zhì)。
[0011]其中，所述的步驟(I)中，豬的脂肪取自皮下脂肪，品系不限。
[0012]所述的步驟(3)中，震蕩搖床的轉(zhuǎn)速為240rpm，震蕩幅度為20mm，在常溫常壓下震蕩 5min。
[0013]應(yīng)用本發(fā)明確定的方法，可以成功提取豬脂肪外基質(zhì)。本生產(chǎn)工藝與現(xiàn)有的人脂肪外基質(zhì)提取工藝相比，采用了豬脂肪作為原料，其來源更為廣泛，且不涉及倫理問題，可進(jìn)行批量生產(chǎn)，克服了使用自體脂肪外基質(zhì)的限制，對該材料進(jìn)一步脫細(xì)胞處理后可生產(chǎn)為生物填充材料。
[0014]本發(fā)明工藝在脂肪勻漿之后，采取震蕩法分離脂肪和脂肪外基質(zhì)，文獻(xiàn)報道(察鵬飛，高建華，陳陽等，人脂肪組織細(xì)胞外基質(zhì)支架的構(gòu)建，中華整形外科雜志，2012，28(1),55-60)使用300ml抽脂獲取的人脂肪可以分離出1ml脂肪外基質(zhì)，采用本發(fā)明分離方法60ml豬脂肪可以分離出5ml脂肪外基質(zhì)，并且離心法需要使用離心管作為分離的容器，受到了容積的限制，降低了生產(chǎn)的效率，而震蕩法分離可以采用大容積的燒杯或者燒瓶，使得產(chǎn)量大大提高。豬的脫細(xì)胞真皮在治療燒傷患者的創(chuàng)傷中已經(jīng)廣泛應(yīng)用，其具有排異反應(yīng)低，組織相容性好的優(yōu)點，本工藝同樣采用豬作為提取脂肪的目標(biāo)，因該生物的生物材料在臨床中應(yīng)用較廣，同時該生物的脂肪含量高，獲取更加容易。
[0015]本發(fā)明的主要優(yōu)點在于:(1)豬的生物材料在臨床中應(yīng)用廣泛，采用豬脂肪作為外基質(zhì)來源，更加安全，來源更廣且不涉及倫理問題，可以產(chǎn)業(yè)化批量生產(chǎn)，避免了原有方法中使用自體脂肪出現(xiàn)的材料不足以及獲取困難的情況；(2)該工藝生產(chǎn)流程簡單，生產(chǎn)材料簡單，產(chǎn)率較原有方法有了很大提高，并且采用了全新的震蕩法分離脂肪和脂肪外基質(zhì)，突破了常規(guī)50ml離心管的容積限制，可以實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。
【附圖說明】
[0016]圖1為:剪碎后的豬脂肪一勻漿前的豬脂肪一勻漿后的組織一震蕩前的組織一震蕩后的組織一離心后的組織一洗滌后的豬脂肪外基質(zhì)各工序的示意圖；
【具體實施方式】
[0017]為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚明了，下面結(jié)合【具體實施方式】，對本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)該理解，這些描述只是示例性的，而并非要限制本發(fā)明的范圍。
[0018]實施例1
[0019](I)取新鮮豬肉的皮下脂肪，將豬脂肪剪碎后用蒸餾水反復(fù)洗滌5-7次，直至將脂肪中的血液成分洗去，將干凈的脂肪碎塊擠壓成漿糊狀，置入燒杯中稱量體積為60ml ；
[0020](2)將漿糊狀的脂肪置入勻漿機中，向勻漿機中加入60ml蒸餾水，勻漿，勻漿機轉(zhuǎn)速為12000rpm，勻漿時間為5min，勻漿溫度為室溫，壓力為大氣壓；
[0021](3)將勻漿后的組織懸液分裝至大燒杯中，靜置5分鐘，燒杯中物質(zhì)分層，燒杯上層為白色粘稠物質(zhì)，下層為透明渾濁液體，將燒杯置于震蕩搖床中震蕩，震蕩搖床的轉(zhuǎn)速為240rpm，震蕩幅度為20mm，震蕩時間為5min，白色脂肪與粘稠凝膠樣物質(zhì)逐漸分離，棄去上層脂肪與中層液體，加入等量蒸餾水，重復(fù)以上操作，直到全部脂肪分離出凝膠樣物質(zhì)；
[0022](4)將獲取的凝膠樣物質(zhì)分裝入50ml離心管中，向各個離心管中加入適量蒸餾水，置入離心機中離心，轉(zhuǎn)速為lOOOrpm，在室溫常壓下離心3min，離心后棄上層液體，重復(fù)3次，最終獲得5ml凝膠樣沉淀，即為豬的脂肪細(xì)胞外基質(zhì).
[0023]使用本發(fā)明的方法，成功從豬的脂肪中分離出的脂肪外基質(zhì)，操作簡便，提取效率高，值得使用和推廣。
[0024]實施例2
[0025]為了說明本發(fā)明提取工藝的優(yōu)勢，我們選用豬作為脂肪來源，并采取常規(guī)的方法(察鵬飛，高建華，陳陽等，人脂肪組織細(xì)胞外基質(zhì)支架的構(gòu)建，中華整形外科雜志，2012，28(1)，55-60)進(jìn)行脂肪外基質(zhì)的提取。
[0026](I)由于抽脂手術(shù)獲取的脂肪充滿了腫脹液，呈液態(tài)，故第一步無法按照常規(guī)方法進(jìn)行，第一步仍然按照本發(fā)明的方法制備漿糊狀脂肪10ml ;
[0027](2)向收集的脂肪組織中按脂肪:水分=2:1的比例加入50ml蒸餾水，轉(zhuǎn)移至勻楽機，12000r/min 勾楽 3min ；
[0028](3)將勻漿后的混合物分裝入50ml離心管中離心，3000r/min，5min，混合物分為兩層，上層為白色物質(zhì)，下層為透明液體，并沒有出現(xiàn)實施例1中的粘稠膠樣物質(zhì)。
[0029]該實施例的步驟(3)中，勻漿后的混合物呈白色團(tuán)塊狀，向50ml離心管中轉(zhuǎn)移的過程中十分麻煩，并且，按照常規(guī)方法離心后并沒有分離出粘稠膠樣物質(zhì)。
[0030]盡管已經(jīng)詳細(xì)描述了本發(fā)明的實施方式，但是應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可以對本發(fā)明的實施方式做出各種改變、替換和變更。
【主權(quán)項】
1.一種豬的脂肪細(xì)胞外基質(zhì)提取方法，其特征在于:包括如下步驟: (1)將新鮮豬脂肪剪碎后用蒸餾水反復(fù)洗滌5-7次，直到洗去脂肪中混合的血液成分，將干凈的脂肪碎塊擠壓成漿糊狀，置入燒杯中稱量體積； (2)將漿糊狀的脂肪放入勻漿機中，并向勻漿機中加入等體積的蒸餾水，勻漿，勻漿機轉(zhuǎn)速為12000rpm，在室溫常壓下勻漿5min ； (3)將勻漿后的組織懸液置于震蕩搖床中震蕩，可觀察到白色脂肪與粘稠凝膠樣物質(zhì)逐漸分離，棄去上層脂肪與中層液體，加入等量蒸餾水，重復(fù)以上操作，直到全部脂肪分離出凝膠樣物質(zhì)； (4)將獲取的凝膠樣物質(zhì)分裝入50ml離心管中，向各個離心管中加入適量蒸餾水，置入離心機中離心，轉(zhuǎn)速為lOOOrpm，在室溫常壓下離心3min，離心后棄上層液體，重復(fù)3次，最終獲得的凝膠樣沉淀即為豬的脂肪細(xì)胞外基質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于:所述的步驟(I)中，豬的脂肪取自皮下脂肪，品系不限。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于:所述的步驟(3)中，震蕩搖床的轉(zhuǎn)速為240rpm，震蕩幅度為20mm，在常溫常壓下震蕩5min。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種豬的脂肪細(xì)胞外基質(zhì)的提取方法，包括如下步驟：(1)將新鮮豬脂肪剪碎后用蒸餾水反復(fù)洗滌；(2)向洗滌后的脂肪中加入蒸餾水，將混合物放入勻漿機中勻漿；(3)將勻漿后的組織懸液置于震蕩搖床中震蕩，白色脂肪與粘稠凝膠樣物質(zhì)逐漸分離，棄去上層脂肪與中層液體，加入等量蒸餾水，重復(fù)以上操作，直到全部脂肪分離出凝膠樣物質(zhì)；(4)將獲取的凝膠樣物質(zhì)置入離心機中離心，離心后棄上層液體，反復(fù)清洗，獲得凝膠樣沉淀即為豬的脂肪細(xì)胞外基質(zhì)。本發(fā)明應(yīng)用豬的脂肪細(xì)胞，生產(chǎn)工藝流程簡潔，生產(chǎn)原材料易獲取，生產(chǎn)耗時短，且提取產(chǎn)率高，可用作注射用填充材料的生產(chǎn)。
【IPC分類】C12N5-071, A61L27-36
【公開號】CN104877956
【申請?zhí)枴緾N201510354204
【發(fā)明人】劉天一, 盧勇舟, 畢波, 郭妤, 楊平, 朱晶晶, 周軼群, 陳亮, 楊清建, 賈傳龍
【申請人】華東醫(yī)院
【公開日】2015年9月2日
【申請日】2015年6月23日