長鏈非編碼rna afap1-as1在制備乳腺癌實時熒光定量輔助診斷制劑上的應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于腫瘤分子生物學領域，具體涉及長鏈非編碼RNA AFAP1-AS1的引物、檢 測試劑及其應用。
【背景技術】
[0002] 人類基因組計劃及其后續(xù)的DNA元件百科全書計劃（The Encyclopedia of DNA Elements Pr〇ject，ENCODE)研宄成果表明，蛋白編碼基因序列僅占人類基因組序 列的1-3%，而人基因組中絕大部分可轉錄的序列為長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，IncRNA)。LncRNA廣泛地存在于各種生物中，且隨著生物復雜程度的升高，基因組中 IncRNA序列的比例也相應地增大，提示IncRNA在生物進化過程中有重要意義。隨著IncRNA 不斷被發(fā)現(xiàn)，它們的功能逐漸被詮釋，科學家們發(fā)現(xiàn)IncRNA廣泛而活躍地參與到生命活動 不同層面的功能調控中，作為一個嶄新的領域，已經(jīng)成為國際生命科學研宄領域新的前沿 與熱點。
[0003] LncRNA可作為功能蛋白質的信號（signal)、誘導（guide)、誘館（decoy)或支架 (scaffold)分子等多種方式，在染色質重構、基因轉錄、翻譯及蛋白修飾等多重水平調控基 因的表達，并在包括發(fā)育、免疫、生殖等基本生理過程中扮演了不可替代的角色，更重要的 是，IncRNA的表達與功能失調已經(jīng)與包括惡性腫瘤在內的人類多種疾病緊密聯(lián)系在了一 起。因此，深入研宄IncRNA的功能，揭示由IncRNA介導的遺傳信息傳遞方式和表達調控網(wǎng) 絡，不僅可以從蛋白編碼基因以外的角度重新注釋和闡明基因組的結構與功能，深入發(fā)現(xiàn) 生命活動的本質和規(guī)律，還有望從一個新的視角認識包括腫瘤在內的多種人類常見疾病的 發(fā)病機理，并為這些疾病的診斷與治療提供新的分子標志物與治療靶點。
[0004] 乳腺癌的發(fā)病率居女性惡性腫瘤的第一位，自20世紀70年代末開始其發(fā)病率一 直呈上升趨勢，美國8名婦女一生中就會有1人患乳腺癌，而我國乳腺癌發(fā)病率近年來也一 直持續(xù)增長，已成為當前社會的重大公共衛(wèi)生問題，乳腺癌容易發(fā)生轉移，晚期患者預后較 差。研宄表明，這種腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多基因參與、多步驟、多階段的復雜過程，LncRNA在 乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能也起到了重要的作用。最近我們利用IncRNA芯片，構建了乳 腺癌活檢組織及正常對照樣品中IncRNA的表達譜，從中篩選了一些在乳腺癌中差異表達 的IncRNAs，經(jīng)擴大樣本實時熒光定量PCR驗證，證實IncRNA AFAP1-AS1 (NCBI accession number:NR_026892)在乳腺癌中表達顯著上調，且AFAP1-AS1的表達水平與乳腺癌的淋巴 結轉移及臨床分期密切相關，針對該IncRNA的檢測制劑也可以用于乳腺癌的輔助診斷。隨 后，我們進一步增加樣本，在77例有臨床隨訪資料的乳腺癌石蠟存檔標本中，通過原位雜 交（in situ hybridization)的方法檢測了 AFAP1-AS1的表達水平，發(fā)現(xiàn)AFAP1-AS1表達 高的患者更容易發(fā)生轉移，其生存時間短于該IncRNA表達低的患者，因此針對該IncRNA的 檢測制劑也可以用于乳腺癌的預后判斷。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供長鏈非編碼RNA AFAP1-AS1的引物、檢測試劑及其應用，利用 AFAP1-AS1序列得到的引物可以制備用于乳腺癌輔助診斷或者預后預測的制劑。長鏈非編 碼RNA AFAP1-AS1的應用方法，用于制備乳腺癌輔助診斷或者療效預測的實時熒光定量檢 測試劑，該長鏈非編碼RNA AFAP1-AS1的序列如SEQ NO: 1所示。
[0006] 所述的實時熒光定量檢測試劑中包含：
[0007] 用于實時熒光定量檢測AFAP1-AS1表達的引物序列：
[0008] 正向引物：5 ' -AATGGTGGTAGGAGGGAGGA-3 '，
[0009] 反向引物：5 ' -CACACAGGGGAATGAAGAGG-3 '。
[0010] 所述的實時熒光定量檢測制劑為試劑盒。
[0011] 試劑盒中含有：
[0012] 用于實時熒光定量檢測AFAP1-AS1表達的引物序列：
[0013] 正向引物：5 ' -AATGGTGGTAGGAGGGAGGA-3 '，
[0014] 反向引物：5 ' -CACACAGGGGAATGAAGAGG-3 '。
[0015] 內參基因 GAPDH特異性PCR引物：
[0016] 正向引物 5 ' -ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 '
[0017] 反向引物 5 ' -TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3 '。
[0018] 試劑盒中還含有：
[0019] (1)從乳腺癌組織中抽提總RNA所用試劑，包括RNA穩(wěn)定溶液、Trizol試劑、三氯 甲烷、異丙醇、無酶水；
[0020] (2)以總RNA為模板將LncRNA AFAP1-AS1逆轉錄為cDNA所用試劑，包括逆轉錄緩 沖液、三磷酸堿基脫氧核苷酸、RNA酶抑制劑、MMLV逆轉錄酶以及隨機引物；
[0021] (3)將cDNA實時定量PCR所用試劑，包括實時熒光定量SYBR染料、無酶水。
[0022] 我們從乳腺癌和正常乳腺組織樣本中抽提RNA后逆轉錄，實時熒光定量法檢測了 AFAP1-AS1的表達，結果顯示AFAP1-AS1在乳腺癌組織中表達上調。提示AFAP1-AS1可作為 乳腺癌預后預測的分子標志。本發(fā)明為乳腺癌的輔助診斷和預后預測提供了強有力的分子 生物學工具，具有深遠的臨床意義和重要的推廣應用前景。
【附圖說明】
[0023] 圖1為實時熒光定量PCR技術驗證IncRNA AFAP1-AS1在乳腺癌和正常乳腺組織 中的表達情況，AFAP1-AS1在乳腺癌（T)中的表達比正常乳腺組織（N)中顯著提高；
[0024] 圖2為原位雜交檢測AFAP1-AS1在乳腺癌中的表達情況；
[0025] 在79. 22%的乳腺癌（77例乳腺癌組織中的61例）中檢測到有AFAP1-AS1的高表 達（左），其余的16例乳腺癌組織中AFAP1-AS1的表達較低（右）；
[0026] 圖3為乳腺癌中AFAP1-AS1的表達與乳腺癌患者預后的關系，
[0027] 乳腺癌中AFAP1-AS1的高表達與乳腺癌患者的不良預后相關，即AFAP1-AS1高 表達的患者總的生存時間（Over-all survival，左）和無復發(fā)生存時間（Relapse-free sruvival，右）要明顯低于AFAP1-AS1低表達或不表達的患者。
【具體實施方式】
[0028] 以下結合【具體實施方式】進一步說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。
[0029] 實施例1，實時熒光定量PCR法檢測證實AFAP1-AS1在乳腺癌中表達上調
[0030] 1.材料與方法：
[0031] 收集17例正常乳腺組織和104例乳腺癌組織，抽提總RNA，2 μ g RNA經(jīng)逆轉錄成 cDNA 后，進行實時熒光定量PCR。AFAP-ASl 引物為 5' -AATGGTGGTAGGAGGGAGGA-3'，SEQ NO: 8 和 5' -CACACAGGGGAATGAAGAGG-3'，SEQ N0:9。
[0032] 用于對照的 GAPDH 引物為 5' -ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，SEQ N0:10 和 5' -TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'， SEQ N0:11，
[0033] 實時熒光定量PCR反應體系
【主權項】
1. 長鏈非編碼RNA AFAP1-AS1的應用方法，其特征在于，用于制備乳腺癌輔助診斷或 者療效預測的實時熒光定量檢測試劑，該長鏈非編碼RNA AFAP1-AS1的序列如SEQ NO: 1所 不O
2. 根據(jù)權利要求2所述的應用方法，其特征在于，所述的實時熒光定量檢測試劑中包 含用于實時熒光定量檢測AFAP1-AS1表達的引物序列： 正向引物：5 ' -AATGGTGGTAGGAGGGAGGA-3 '， 反向引物：5 ' -CACACAGGGGAATGAAGAGG-3 '。
3. 根據(jù)權利要求1或2所述的應用方法，其特征在于，所述的實時熒光定量檢測制劑為 試劑盒。
4. 根據(jù)權利要求3所述的應用方法，其特征在于，試劑盒中含有： 用于實時熒光定量檢測AFAP1-AS1表達的引物序列： 正向引物：5 ' -AATGGTGGTAGGAGGGAGGA-3 '， 反向引物：5 ' -CACACAGGGGAATGAAGAGG-3 '。 內參基因GAPDH特異性PCR引物： 正向引物 5 ' -ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 ' 反向引物 5 ' -TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3 '。
5. 根據(jù)權利要求3所述的應用方法，其特征在于， 試劑盒中還含有： (1) 從乳腺癌組織中抽提總RNA所用試劑，包括RNA穩(wěn)定溶液、Trizol試劑、三氯甲烷、 異丙醇、無酶水； (2) 以總RNA為模板將LncRNA AFAP1-AS1逆轉錄為cDNA所用試劑，包括逆轉錄緩沖 液、三磷酸堿基脫氧核苷酸、RNA酶抑制劑、MMLV逆轉錄酶以及隨機引物； (3) 將cDNA實時定量PCR所用試劑，包括實時熒光定量SYBR染料、無酶水。
6. 用于制備乳腺癌輔助診斷或者療效預測的制劑的引物序列： 正向引物：5 ' -AATGGTGGTAGGAGGGAGGA-3 '， 反向引物：5 ' -CACACAGGGGAATGAAGAGG-3 '。
7. 用于乳腺癌輔助診斷或者療效預測的實時熒光定量檢測試劑，是包含有權利要求6 所述的引物的試劑盒。
8. 根據(jù)權利要求7所述的實時熒光定量檢測試劑，其特征在于，試劑盒中還含有內參 基因GAPDH特異性PCR引物： 正向引物 5 ' -ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 ' 反向引物 5 ' -TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3 '。
9. 根據(jù)權利要求8所述的實時熒光定量檢測試劑，其特征在于，試劑盒中還含有： (1) 從乳腺癌組織中抽提總RNA所用試劑，包括RNA穩(wěn)定溶液、Trizol試劑、三氯甲烷、 異丙醇、無酶水； (2) 以總RNA為模板將LncRNA AFAP1-AS1逆轉錄為cDNA所用試劑，包括逆轉錄緩沖 液、三磷酸堿基脫氧核苷酸、RNA酶抑制劑、MMLV逆轉錄酶以及隨機引物； (3) 將cDNA實時定量PCR所用試劑，包括實時熒光定量SYBR染料、無酶水。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種長鏈非編碼RNA AFAP1-AS1在制備乳腺癌實時熒光定量輔助診斷制劑上的應用。通過研究證實AFAP1-AS1在乳腺癌組織中表達上調，高表達AFAP1-AS1的乳腺癌患者比低表達AFAP1-AS1的乳腺癌患者預后差，因此，將AFAP1-AS1的表達用于乳腺癌患者的輔助診斷和預后預測，可以為乳腺癌患者的預后提供強有力的分子生物學依據(jù)，具有深遠的臨床意義和重要的推廣應用前景。
【IPC分類】C12N15-11, C12N15-113, C12Q1-68
【公開號】CN104878011
【申請?zhí)枴緾N201510266821
【發(fā)明人】李桂源, 曾朝陽, 熊煒, 石磊, 孛昊, 李小玲, 李夏雨, 龔朝建, 范松青, 張文玲, 周鳴, 彭淑平
【申請人】中南大學
【公開日】2015年9月2日
【申請日】2015年5月22日