一種用于體外檢測Neurofibromastosis2疾病致病基因NF2的c.602delTG突變的試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測NF2基因 c. 602delTG突變的試劑盒，該試劑盒可用于該疾病 的輔助診斷和新藥開發(fā)，屬于生物技術領域。
【背景技術】
[0002] 神經纖維瘤病2型疾?。╪eurofibromatosis type2，NF2)是一種常染色體遺傳疾 病，其主要特征為雙側聽神經瘤（圖1)，常伴發(fā)顱內和髓內神經鞘瘤、腦膜瘤和室管膜瘤等 多種腫瘤。多數腫瘤為良性，但是由于這些腫瘤位于顱內或椎管內造成神經或腦組織的壓 迫，引起一系列嚴重癥狀，主要包括聽力喪失，視力下降，四肢肌力減退，面部感覺減退，目艮 臉閉合不全，咽反射消失，皮下結節(jié)等，NF2的發(fā)病率高，約1/25 000,且自發(fā)突變率高，外 顯率100%。由于NF2表型多樣，NIH確定了 NF2的診斷標準：① CT或MRI顯示雙側聽神經 瘤；②直系一級親屬患NF2以及單側聽神經瘤或至少有以下病變中的2個：神經纖維瘤、腦 膜瘤、膠質瘤、神經鞘瘤和青少年晶狀體后包膜下混濁。
[0003] NF2基因定位于22號染色體長臂1區(qū)二帶（22ql2)，長約110 000 bp，編碼區(qū) cDNA長為1785bp，含17個外顯子，通過選擇剪接產生兩個主要蛋白亞型schwannomin或 Merlin。這個蛋白屬于Ezrin，Radixin，Moesin(ERM)家族，主要在細胞骨架和細胞膜之間 起連接作用。但是，NF2也是一個腫瘤抑制基因，NF2功能失活不但與家族性神經系統(tǒng)腫瘤 有關而且與散發(fā)的神經系統(tǒng)腫瘤有關。NF2基因編碼蛋白Merlin可以抑制細胞增殖，同時 其可以與核內泛素連接酶E3相互作用，抑制調控細胞周期基因表達和激活細胞凋亡基因 表達。更重要是，Merlin通過多種生物信號通路參與了腫瘤抑制作用。目前，發(fā)現Merlin 通過酪氨酸受體激酶通路，抑制細胞增殖，而NF2患者Merlin蛋白失活，使得酪氨酸受體激 酶（RTKs)通路激活，促進細胞異常增殖。在RTKs-ERK/MAPK通路中Rac、Pakl蛋白起到重要 的作用。Paks(p212activated kinases)是具致癌性的Rac/Q)C42依賴的Ser/Thr激酶，整 聯蛋白信號肽（細胞黏附相關分子）通過Paks將Merl in磷酸化使其失活，促使正常細胞 進行有絲分裂;Merlin對Racl起負性調節(jié)，抑制其下游效應物Paks，從而抑制了細胞生長， 或Merlin直接抑制Paks活性阻斷Rac介導的信號通路。此外，發(fā)現表皮生長因子受體家 族（ErbB家族），包括血管生長因子受體（EGFR)和血小板來源的生長因子受體（PDGFRb)， 通絡酪氨酸受體激酶（RTKs)通路參與了 NF2腫瘤的形成，在Merlin基因缺失細胞中發(fā)現 抑制EGFR信號通路的藥物可以抑制細胞的生長。在神經鞘瘤的組織標本中發(fā)現許多ErbB 家族蛋白的表達?？笶rbB家族蛋白抗體可以抑制神經鞘瘤細胞的增殖。在臨床前期雙側 聽神經瘤模型實驗中發(fā)現表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑埃羅替尼可以有效的抑制 腫瘤細胞的增殖。最近，研宄報道血管生長因子單克隆抗體阿瓦斯汀改善NF2患者的聽力 功能。
[0004] 目前在基因水平對NF2型疾病進行篩查的方法或試劑盒還未曾報道。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的一個目的是提供一種用于輔助診斷神經纖維瘤病2型疾病的試劑盒。
[0006] 本發(fā)明所提供的用于輔助診斷NF2型疾病的試劑盒，包括如下引物對：SEQ ID NO : 1 和 SEQ ID NO :2。
[0007] 本發(fā)明的另一個目的是提供如下突變位點的用途：NF2基因的第2個外顯子中 c. 602-603位處的核苷酸TG缺失。
[0008] 該用途是在制備輔助診斷NF2型疾病的試劑盒中的應用。具體是針對該突變位點 設計能夠檢測出該突變位點的引物對，即得到輔助診斷NF2型疾病的試劑盒。
[0009] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種與NF2型疾病相關的突變位點。
[0010] 本發(fā)明所提供的與NF2型疾病相關的突變位點如下：NF2基因的第2個外顯子中 c. 602-603位核苷酸TG缺失。
[0011] 本發(fā)明首次發(fā)現了神經纖維瘤病2型（NF2)疾病致病基因 NF2的c. 602delTG突 變，并且證明該突變位點與NF2疾病相關。進一步設計了檢測該突變位點的引物，并將其用 于診斷NF2疾病。實驗證明，該引物可特異地、準確得診斷出NF2疾病患者。該診斷方法簡 單、成本低，檢測結果直接、可靠，適用于對NF2疾病NF2基因 c. 602delTG突變的大規(guī)模的 篩查和診斷。通過產前篩查及新生兒NF2基因突變篩查，可以降低NF2疾病患兒的出生率， 指導攜帶致病基因的患者生活行為，預防疾病發(fā)生，大大緩解社會壓力。體外檢測NF2疾病 相關基因 NF2的c. 602delTG突變的試劑盒對于這些學科研宄與發(fā)展都是不可或缺的。
【附圖說明】
[0012] 圖1為關于NF2患者臨床表現：雙側聽神經瘤（如箭頭所示）。
[0013] 圖2為NF2基因 c. DNA編碼區(qū)氨基酸與核苷酸堿基的對照：突變位于第602個堿 基，第54位的氨基酸變?yōu)榉g終止信號（灰色標記插入的堿基，其后氨基酸缺失表達）。
[0014] 圖3為本發(fā)明NF2基因雜合突變中PCR反應過程示意圖，示出反應溫度和反應時 間。
[0015] 圖4為本發(fā)明方法NF2基因外顯子2的部分測序結果，上方為突變序列，下方位正 常對照序列，箭頭所指為突變位點。
【具體實施方式】
[0016] 本發(fā)明所用試劑材料，如無特別說明，均為市售購買產品。
[0017] 實施例1、與神經纖維瘤病2型疾病相關的NF2基因突變位點c. 602delTG的發(fā)現
[0018] 通過神經外科門診收集NF2患者，在患者及家屬自愿的前提下，簽署知情同意書 后，留取5-10ml血樣，建立住院病歷資料庫，詳細記錄患者病情、家系中發(fā)病情況以及聯系 方式。然后應用酚氯仿抽提方法提取基因組DNA，定量后入庫，-20°C保存，每份DNA均準確 對應登記的患者臨床資料。根據Primer Premier5. 0進行設計引物，包含NF2基因602位點 及兩側序列，進行PCR擴增。對PCR產物進行直接測序，測序引物與PCR擴增引物相同，應 用ABI公司3730DNA測序儀進行反向測序。將得到的序列與Genbank中的標準序列比對， 確定602突變位點。按正常閱讀框進行翻譯以確定NF2基因突變位點。
[0019] 結果：通過對36例NF2疾病患者及6例正常對照的NF2基因編碼區(qū)外顯子的篩查 發(fā)現一名患者在外顯子2上具有NF2基因新的突變。該突變點為雙核苷酸缺失突變。NF2疾 病患者為雜合子，即一個等位基因為NF2基因的第2個外顯子中c. 602-603位核苷酸TG缺 失，將該突變記作c. 602delTG突變。這個突變在6例對照組中均未被發(fā)現。正常人在此處不 存在任何突變，為純合基因型，即兩個等位基因均為NF2基因的第2個外顯子中c. 602-603 位核苷酸為TG (圖2)。說明這一突變位點與NF2疾病相關。存在c. 602delTG突變的為NF2 疾病患者。
[0020] 實施例2、用于NF2型疾病的診斷試劑盒及其應用
[0021] 一、試劑盒組成
[0022] 上游引物：NF2602-F :5，-CCTTCCCCATTGGTTTGTTATTG-3，（SEQ ID NO :1);
[0023] 下游引物：NF2602-R :5，-CcAGGGCCAGCAGCAGTCTAATC-Sr (SEQ ID NO ：2)；
[0024] 50ul IOX PCR 緩沖液（Pharmacia)，
[0025] IOul IOmM dNTP 混合液（Pharmacia)，
[0026] 5ul (5unit/ul) Taq DNA 聚合酶（Takara)，
[0027] 各 IOul (lOpmol/ul) Fl (SEQ ID NO :1)和 Rl (SEQ ID NO :2)引物，
[0028] Iml純水（自制）。
[0029] 二、試劑盒應用
[0030] (一）診斷材料：
[0031] 共36例NF2疾病患者及6例正常人的外周血血樣。
[0032] 通過神經外科門診收集NF2患者，在患者及家屬自愿的前提下，簽署知情同意書 后，留取5-10ml血樣，建立住院病歷資料庫，詳細記錄患者病情、家系中發(fā)病情況以及聯系 方式。本研宄已得到了本單位倫理委員會批準。
[0033] (二）診斷方法
[0034] 1、基因組DNA的提?。?br>[0035] 第一天：在抗凝劑EDTA存在下，將收集的5-10ml人外周血在2500rpm，離心分離 30分鐘除去血清；加入0. 2 % NaCl溶液，使總體積為50ml。輕輕振蕩溶液5-6次，并使其放 置于冰上15分鐘；在2500rpm離心分離30分鐘，借此收集沉淀物；用0. 2%的NaCl溶液， 以類似于前面的方式再進行洗滌；在如此獲得的沉淀物中，加入IOmMTris-HCl (pH8.0)和 IOmM EDTA(4ml)，以懸浮該沉淀物；將 10% SDS，25mg/ml 的蛋白酶 K 和 10mg/ml 的 RNaseA 加入懸液中，其加入量分別為4ml、16ul和20ul，接著上下顛倒懸液輕輕混合；在37°C過夜 溫育懸液。
[0036] 第二天：加入4ml酚/Tris溶液，上下顛倒混合物混合所得的混合物；以3000rpm 進行離心分離10分鐘除去水層；將水層和4ml酚/氯仿溶液混合，接著逆混合并以 3000rpm離心分離10分鐘；除去水層，用氯仿提取兩次，以獲得水相，往其中加1/10,3M NaAC (pH5. 2)，兩倍量的冷無水乙醇，使DNA沉淀；用70%的乙醇洗滌以獲得基因組DNA ;使 這樣獲得的DNA，基因組DNA溶解于TE中，然后定量測定混合物在260nm的吸收率；DNA工 作液濃度校正至50ng/ul，置-20°C冰箱保存。
[0037] 2、PCR 擴增
[0038] PCR反應體系
[0039]
【主權項】
1. 一種用于輔助診斷NF2型疾病的試劑盒，包括如下引物對：SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2〇
2. 如下突變位點在制備輔助診斷NF2型疾病的試劑盒中的應用：NF2基因的第2個外 顯子中c. 602-603位核苷酸TG缺失。
3. -種與NF2型疾病相關的突變位點：NF2基因的第2個外顯子中c. 602-603位核苷 酸TG缺失。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于體外檢測Neurofibromastosis 2疾病致病基因NF2的c.602delTG突變的試劑盒。該試劑盒包括如下引物對：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。本發(fā)明首次發(fā)現了NF2疾病致病基因NF2的c.602delTG突變，并且證明該突變位點與NF2疾病相關。進一步設計了檢測該突變位點的引物，并將其用于診斷NF2疾病。通過產前篩查及新生兒NF2基因突變篩查，可以降低NF2疾病患兒的出生率，指導攜帶致病基因的患者生活行為，預防疾病發(fā)生，大大緩解社會壓力。體外檢測NF2疾病相關基因NF2的c.602delTG突變的試劑盒對于這些學科研究與發(fā)展都是不可或缺的。
【IPC分類】C12Q1-68
【公開號】CN104878080
【申請?zhí)枴緾N201410306409
【發(fā)明人】張俊廷, 郝淑煜, 馮潔, 李達, 吳震, 王亮, 張力偉
【申請人】首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院
【公開日】2015年9月2日
【申請日】2014年6月26日