〇l，與空載體組相比；##，P〈〇.〇l，與Ρ311高表達(dá) 組相比。
[0022] 圖4、外源性TGFM可以恢復(fù)Ρ311敲除引起的細(xì)胞功能缺陷。免疫印跡檢測 α -平滑肌肌動蛋白的蛋白水平。*，Ρ〈0. 05,與Ρ311敲除型空白對照組相比；**，Ρ〈0. 01， 與野生型空白對照組相比；##，Ρ〈0. 01，與敲除型TGFI3 1刺激組相比。
【具體實施方式】
[0023] 為了更好地理解本發(fā)明，下面通過實例對本方面進(jìn)行具體的描述。本申請中未明 確記載的實驗步驟和條件，則采用常規(guī)的實驗步驟和條件。免疫印跡法、熒光素酶活性檢 測、免疫熒光染色均參考《分子克隆實驗指南（第三版）》（科學(xué)出版社）和《組織和細(xì)胞培 養(yǎng)技術(shù)》（人民衛(wèi)生出版社）。
[0024] 實施例1 Ρ311對小鼠表皮干細(xì)胞中TGFβ 1的調(diào)控作用
[0025] 細(xì)胞培養(yǎng)和處理方式：Ρ311野生型和敲基因小鼠由Gregory A Taylor教授饋贈 (美國杜克大學(xué)醫(yī)學(xué)教研室，敲除序列如SEQ ID No. 2)。利用經(jīng)典的兩步消化法和差速貼 壁法分離并培養(yǎng)1日齡小鼠的表皮干細(xì)胞，利用CD71和CD49f流式鑒定表皮干細(xì)胞純度為 95%以上。原代表皮干細(xì)胞達(dá)到70%匯合時，分別轉(zhuǎn)染已構(gòu)建好的P311腺病毒表達(dá)載體和 Myc空載體（兩種載體均購自重慶金麥生物技術(shù)有限公司），24h后觀察轉(zhuǎn)染比例并換液， 72h后檢測各項指標(biāo)。
[0026] 檢測各細(xì)胞部位、不同合成階段的TGF β 1 :轉(zhuǎn)染72h后，常規(guī)方法提取細(xì)胞內(nèi)總蛋 白和RNA。免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn)，P311高表達(dá)的表皮干細(xì)胞TGFβ 1前體和活性TGFβ 1蛋白 的水平分別顯著升高到對照組的4. 21和6. 89倍（圖1A、B、C)。酶聯(lián)免疫法檢測Ρ311野生 型表皮干細(xì)胞的培養(yǎng)上清內(nèi)總TGF β 1水平較對照組顯著升高（圖1D)實時定量PCR檢測 發(fā)現(xiàn)，Ρ311高表達(dá)的表皮干細(xì)胞TGFI3 I mRNA水平較對照組顯著下降（圖1Ε)，同時TGF0 I 型受體和II型受體mRNA水平分別升高到對照組的1. 72和2. 22倍（圖1F、G)，且均有統(tǒng) 計學(xué)意義。。
[0027] 綜上，本實施例證實了 P311可以促進(jìn)表皮干細(xì)胞TGF β 1的合成和分泌。
[0028] 實施例2 Ρ311調(diào)控TGF β 1的具體機(jī)制。
[0029] 細(xì)胞培養(yǎng)和處理方式：小鼠原代表皮干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定同實施例1，原代 表皮干細(xì)胞達(dá)到70%匯合時，分別轉(zhuǎn)染已構(gòu)建好的Ρ311腺病毒表達(dá)載體和Myc空載體（兩 種載體根據(jù)SEQ ID No. 2設(shè)計，委托重慶金麥生物技術(shù)有限公司構(gòu)建合成），24h后觀察轉(zhuǎn) 染比例并換液，造成人為強(qiáng)制高表達(dá)P311。
[0030] 觀察P311對TGF β 1啟動子活性的影響。P311強(qiáng)制高表達(dá)后，加入TGF β 1啟動子 質(zhì)粒，利用雙熒光酶報告系統(tǒng)檢測熒光信號強(qiáng)度，檢測P311對TGFf3 1啟動子活性的影響。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，P311高表達(dá)組的啟動子活性略微低于空載體組，且具有統(tǒng)計學(xué)意義（圖2A)。
[0031] 觀察P311對TGFf3 I mRNA穩(wěn)定性的影響。P311強(qiáng)制高表達(dá)后，加入放線菌素（其 可結(jié)合RNA聚合酶而抑制mRNA合成），0h、3h、6h、12h、24h提取RNA，realtimePCR檢測不同 時間點TGFf3 1的水平并計算降解率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，P311高表達(dá)組的降解速率（回歸線斜率） 略微高于空載體組（圖2B)。
[0032] 觀察P311對TGF β 15' /3' -UTR活性的影響。構(gòu)建TGF β 15' /3' -UTR表達(dá)質(zhì)粒 (三種質(zhì)粒皆委托重慶金麥生物技術(shù)有限公司構(gòu)建合成），在小鼠原代表皮干細(xì)胞中轉(zhuǎn)染 Ρ311腺病毒，成功后加入TGF β 15' /3' -UTR表達(dá)質(zhì)粒，利用雙熒光酶報告系統(tǒng)檢測熒光信 號強(qiáng)度，檢測Ρ311對TGFI3 15' /3' -UTR活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空載體組相比，Ρ311可 以顯著提高3' -UTR和5' /3' -UTR的活性，而對5' -UTR的活性沒有顯著影響（圖2C)。提 示Ρ311主要通過提高TGF β 13' -UTR活性來促進(jìn)TGF β 1蛋白翻譯。
[0033] 綜上，本實施例證實了 Ρ311蛋白可能通過提高TGFI3 13' -UTR活性，進(jìn)而促進(jìn) TGF β 1蛋白翻譯。
[0034] 實施例3 Ρ311發(fā)揮類似TGF β 1的生物學(xué)效應(yīng)
[0035] 細(xì)胞培養(yǎng)和處理方式：按前述方法（實施例1)分離培養(yǎng)小鼠表皮干細(xì)胞并人 為高表達(dá)Ρ311，24小時轉(zhuǎn)染成功后，向培養(yǎng)基中加入5 μΜ LY2109761 (Selleck，S2704)， 繼續(xù)培養(yǎng)48小時。TGF恢復(fù)實驗中，向培養(yǎng)基中加入10ng/ml TGF β I (Life invitrogen, PHG9214)，培養(yǎng) 72 小時。
[0036] P311發(fā)揮類似TGF β 1的轉(zhuǎn)分化作用并可被TGF β 1抑制劑阻斷：上述時間點收集 細(xì)胞，相差顯微鏡檢測發(fā)現(xiàn)P311高表達(dá)的表皮干細(xì)胞由立方形變?yōu)殚L梭形，而LY2109761 組則無這種改變（圖3A)。免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)P311高表達(dá)后α -平滑肌肌動蛋白陽性細(xì)胞 數(shù)目增多，而上皮細(xì)胞鈣粘蛋白陽性細(xì)胞數(shù)目降低，加入LY2109761后，Ρ311引起的這些改 變均未出現(xiàn)（圖3Β)。定量分析發(fā)現(xiàn)，Ρ311高表達(dá)組中含有約40%的平滑肌肌動蛋白陽性 細(xì)胞，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于空載體組和P311+LY2109761組（圖3C);而Ρ311高表達(dá)組中的上皮細(xì)胞鈣 粘蛋白陽性細(xì)胞比例（約10% )遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于空載體組和P311+LY2109761組（均大于40%， 如圖3D)
[0037] 外源性TGF β 1可以恢復(fù)Ρ311敲除引起的細(xì)胞功能缺陷：免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn)， TGFf3 1刺激后，Ρ311野生型和敲基因型表皮干細(xì)胞的α -平滑肌肌動蛋白均有顯著升高， 但Ρ311野生型組仍然高于敲基因組。而實際上，無刺激時，Ρ311基因敲除的表皮干細(xì)胞內(nèi) α -平滑肌肌動蛋白蛋白水平低于Ρ311野生型，而TGFf3 1刺激后的Ρ311敲基因小鼠中的 α -平滑肌肌動蛋白的蛋白水平與無 TGFβ 1刺激的Ρ311野生型小鼠中的α -平滑肌肌動 蛋白的蛋白水平并無顯著差異（圖4)，即外源性的TGFM恢復(fù)了因 Ρ311敲除引起的α-平 滑肌肌動蛋白下降。
[0038] 綜上，本實施例驗證了 Ρ311蛋白具有與TGFβ 1相類似的生物學(xué)效應(yīng)。
【主權(quán)項】
1. 調(diào)控蛋白P311在制備調(diào)控轉(zhuǎn)化生長因子M表達(dá)的藥物中的用途。2. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于：所述的調(diào)控蛋白P311具有如SEQIDNo. 1 所示的氨基酸序列。3. 如權(quán)利要求1或2所述的用途，其特征在于：編碼調(diào)控蛋白P311的基因具有如SEQ IDNo. 2所示的核苷酸序列。4. 特異調(diào)控轉(zhuǎn)化生長因子M合成的藥物，其特征在于：其主要活性成分為P311蛋 白。5. 如權(quán)利要求4所述的藥物，其特征在于：所述的P311蛋白具有如SEQIDNo. 1所示 的氨基酸序列。6. 如權(quán)利要求4或5所述的藥物，其特征在于：編碼蛋白P311的基因具有如SEQID No. 2所示的核苷酸序列。
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)治療技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGFβ1)調(diào)控蛋白P311的應(yīng)用。本發(fā)明提供了調(diào)控蛋白P311在制備調(diào)控轉(zhuǎn)化生長因子β1表達(dá)的藥物中的用途。本發(fā)明還提供了特異調(diào)控轉(zhuǎn)化生長因子β1合成的藥物，其主要活性成分為P311蛋白。P311蛋白是一種理想的用于調(diào)控TGFβ1的小分子藥物。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)并證實了P311蛋白可以促進(jìn)TGFβ1的合成，并發(fā)揮與TGFβ1類似的生物學(xué)效應(yīng)。本發(fā)明為治療以TGFβ1為主要發(fā)病機(jī)制的相關(guān)疾病提供一種新選擇。
【IPC分類】A61K38/17, C12N15/12, A61P35/00, C07K14/47, A61P43/00
【公開號】CN104892747
【申請?zhí)枴緾N201510364154
【發(fā)明人】李海勝, 羅高興, 吳軍, 賀偉峰, 張路, 楊思思, 譚江琳, 周峻嶧
【申請人】中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院
【公開日】2015年9月9日
【申請日】2015年6月26日