一種鐵皮石斛多糖的純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種多糖的純化方法。
【背景技術(shù)】
[0002]石斛屬，于1799被Olaf Swartz發(fā)現(xiàn)，為蘭科最大屬之一，共有1100余種，廣泛分布于亞洲、歐洲及大洋洲等熱帶及亞熱帶地區(qū)。我國(guó)約有74余種石斛，主要分布于西南、華東及華南地區(qū)。在中國(guó)的所有石斛藥材中，鐵皮石斛被傳統(tǒng)的中醫(yī)認(rèn)為有最好的藥用價(jià)值，自古以來(lái)便是我國(guó)的名貴藥材?，F(xiàn)代中醫(yī)理論認(rèn)為，鐵皮石斛(Dendrobium officinale)具有健脾養(yǎng)胃、滋陰補(bǔ)腎、潤(rùn)肺生津等功效，用于治療慢性萎縮性胃炎、高血壓、糖尿病等，具備增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤、抗衰老等功效。
[0003]石斛的化學(xué)成分多種多樣，其主要有效成分為石斛類多糖、生物堿等。從草本植物中分離得到的天然多糖被證明有著積極的生物活性，并且應(yīng)用于免疫相關(guān)疾病的治療。20世紀(jì)80年代后期，中國(guó)研宄人員致力于石斛多糖的提取，目的是開發(fā)以多糖為基礎(chǔ)的有著增強(qiáng)機(jī)體健康功能的產(chǎn)品。然而，傳統(tǒng)的多糖純化方法步驟繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、損失大、且一次操作可以純化的樣品量少，無(wú)法實(shí)現(xiàn)純多糖的工業(yè)化制備，這也是困擾多糖發(fā)展的一大難題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種鐵皮石斛多糖的高效純化方法，該方法操作簡(jiǎn)便、耗能低、無(wú)淀粉污染、得率高，極大地提高了石斛多糖的純化效率。
[0005]經(jīng)過(guò)大量研宄，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)由于淀粉在熱水中可以明膠化化并溶解，因此用熱水法提取的粗多糖會(huì)含有淀粉。組織化學(xué)研宄和冷場(chǎng)掃描電鏡證明石斛植物的薄壁細(xì)胞中存在淀粉顆粒，并且這些淀粉即為混雜于石斛多糖中的主要雜質(zhì)成分。因此，高效率、低成本地去除淀粉，是制備鐵皮石斛多糖純品的關(guān)鍵步驟。發(fā)明人通過(guò)甲基化分析發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛多糖中不存在首尾相連的α-1，4-葡萄糖苷鍵，所以工藝過(guò)程中采用α-淀粉酶處理非常有效地除去了石斛多糖中的淀粉。
[0006]本發(fā)明具體技術(shù)方案如下:
[0007]一種鐵皮石斛多糖的純化方法，步驟如下:
[0008]1、原料:以鐵皮石斛干品為原料；
[0009]2、粉碎:用粉碎機(jī)將鐵皮石斛干品進(jìn)行粉碎；
[0010]3、過(guò)篩:粉碎后的原料進(jìn)行分級(jí)過(guò)篩60-80目；
[0011]4、脫脂:將石斛粗粉用10-20倍有機(jī)溶劑回流2-4次進(jìn)行脫脂，之后離心分離，去除有機(jī)溶劑，收集藥渣；
[0012]5、水提:向藥渣中加入20-40倍蒸餾水，在70°C溫度下進(jìn)行水提，將上述水提液進(jìn)行抽濾，獲得濾液，并重復(fù)水提3-4次，合并濾液；
[0013]6、真空濃縮:將所得濾液進(jìn)行真空濃縮(真空度-0.1MPa)，濃縮至原有體積的1/6 ；
[0014]7、醇沉:向濃縮液中緩緩加入無(wú)水乙醇，邊攪拌，邊加入，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到80%時(shí)停止加入，20 °C靜置12-24h ；
[0015]8、離心分離:醇沉過(guò)夜后，將溶液進(jìn)行離心，棄去上層有機(jī)試劑，收集沉淀；
[0016]9、多糖粗品:將沉淀置于通風(fēng)處，使其中的乙醇揮發(fā)殆盡，冷凍干燥得到多糖粗品;
[0017]10、復(fù)溶:將粗多糖按質(zhì)量比1:100復(fù)溶于水，邊溶解邊攪拌，直至完全溶解；
[0018]11、向溶液中加入耐熱型α-淀粉酶，水浴溫度為70°C，反應(yīng)l_3h，期間不斷進(jìn)行攪拌；
[0019]12、凍融離心:反應(yīng)結(jié)束后，待溶液冷卻即放入-80°C冰箱中速凍，然后取出在25°C環(huán)境中融化，融化后離心，收集上清液，重復(fù)這一步驟3-4次；
[0020]13、透析:將所得溶液置于透析袋中進(jìn)行透析，相對(duì)截留分子量為3500D，透析48h ；
[0021]14、醇沉:透析結(jié)束后，向溶液中加入3倍溶液體積的無(wú)水乙醇，邊加入邊攪拌，20 °C靜置沉淀12-24h ；
[0022]15、離心分離:醇沉過(guò)夜后進(jìn)行離心分離，去除乙醇，收集沉淀；
[0023]19、冷凍干燥:將沉淀進(jìn)行真空冷凍干燥，即制得鐵皮石斛多糖純品。
[0024]為了達(dá)到更好的技術(shù)效果，步驟(4)加入了耐熱型α -淀粉酶，并設(shè)定酶的活力濃度至 6000U/L，70°C反應(yīng) l_3h。
[0025]步驟(4)所述有機(jī)溶劑為95 %乙醇溶液。
[0026]為了更好地進(jìn)行產(chǎn)品質(zhì)量控制，制備方法步驟19后面還包括質(zhì)控步驟，包括鐵皮石斛多糖純品的得率測(cè)定(以粗多糖質(zhì)量計(jì))，純多糖成分分析，以及純多糖均一性分析:
[0027](I)鐵皮石斛多糖純品的得率測(cè)定:將凍干后的純多糖稱重，以粗多糖質(zhì)量計(jì)算純品得率，純品得率=(純多糖質(zhì)量/粗多糖質(zhì)量)X100% ；
[0028](2)鐵皮石斛多糖純品成分分析:采用苯酚硫酸法測(cè)定純品中中性糖含量，硫酸咔唑法測(cè)定純品中糖醛酸含量，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定純品中蛋白含量，國(guó)標(biāo)法測(cè)定純品中淀粉、灰分和水分含量；
[0029](3)鐵皮石斛多糖純品分子量分布和均一性檢測(cè):采用高效分子排阻色譜(HPSEC)系統(tǒng)對(duì)多糖純品進(jìn)行分子量分布和均一性檢測(cè)。本方法的特色在于在鐵皮石斛多糖的特有性質(zhì)，制定了一種新型、快速的多糖純化方式，解決了以往多糖純化過(guò)程中不可避免的“步驟多、高損失、低效率、雜質(zhì)多”的問(wèn)題，解決了純多糖難以產(chǎn)業(yè)化的難題。所獲得的多糖得率高、操作簡(jiǎn)便、耗能低、無(wú)淀粉污染。
【具體實(shí)施方式】
[0030]實(shí)施例1:
[0031]用粉碎機(jī)將干燥的石斛樣品進(jìn)行粉碎，過(guò)篩，取80目石斛粉100g。用15倍的95%乙醇回流2次脫脂，之后除去有機(jī)試劑并收集藥渣。藥渣用30倍的蒸餾水水提4次，每次2h，之后抽濾，合并濾液。將濾液真空(真空度-0.1MPa)濃縮至原有體積的1/6，加入無(wú)水乙醇，至乙醇濃度達(dá)到80%。低溫過(guò)夜醇沉24h，將乙醇沉淀液離心分離，冷凍干燥得粗品。取上述粗品，按質(zhì)量比1:100復(fù)溶于蒸飽水中。向溶液中加入耐熱型α -淀粉酶(購(gòu)自丹麥諾維信公司，型號(hào)BAN480L)至6000U/L，70°C水浴2h，期間不停攪拌。反應(yīng)結(jié)束后放入-80°C冰箱中速凍，然后取出于室溫融化，再離心，取上清液，重復(fù)這一步驟4次。將所得溶液置于透析袋中進(jìn)行透析，相對(duì)截留分子量為3500D，透析48h。之后，加入3倍溶液體積的無(wú)水乙醇，20°C靜置沉淀24h。離心，收集沉淀，冷凍干燥，即制得鐵皮石斛多糖純品。得率彡58.8%，純多糖中中性糖含量多88.4%，無(wú)淀粉。
[0032]實(shí)施例2:
[0033]用粉碎機(jī)將干燥的石斛樣品進(jìn)行粉碎，過(guò)篩，取80目石斛粉100g。用15倍的95%乙醇回流2次脫脂，之后除去有機(jī)試劑并收集藥渣。藥渣用30倍的蒸餾水水提3次，每次2h，之后抽濾，合并濾液。將濾液真空(真空度-0.1MPa)濃縮至原有體積的1/6，加入無(wú)水乙醇，至乙醇濃度達(dá)到80%。低溫過(guò)夜醇沉12h，將乙醇沉淀液離心分離，冷凍干燥得粗品。取上述粗品，按質(zhì)量比1:100復(fù)溶于蒸餾水中。向溶液中加入耐熱型α -淀粉酶購(gòu)自丹麥諾維信公司，型號(hào)BAN480L)至6000U/L，70°C水浴3h，期間不停攪拌。反應(yīng)結(jié)束后放入_80°C冰箱中速凍，然后取出于室溫融化，再離心，取上清液，重復(fù)這一步驟3次。將所得溶液置于透析袋中進(jìn)行透析，相對(duì)截留分子量為3500D，透析48h。之后，加入3倍溶液體積的無(wú)水乙醇，20°C靜置沉淀24h。離心，收集沉淀，冷凍干燥，即制得鐵皮石斛多糖純品。得率多58%,純多糖中中性糖含量多85%，無(wú)淀粉。
[0034]實(shí)施例3:
[0035]用粉碎機(jī)將干燥的石斛樣品進(jìn)行粉碎，過(guò)篩，取80目石斛粉100g。用10倍的95%乙醇回流3次脫脂，之后除去有機(jī)試劑并收集藥渣。藥渣用20倍的蒸餾水水提4次，每次2h，之后抽濾，合并濾液。將濾液真空(真空度-0.1MPa)濃縮至原有體積的1/6，加入無(wú)水乙醇，至乙醇濃度達(dá)到80%。低溫過(guò)夜醇沉12h，將乙醇沉淀液離心分離，冷凍干燥得粗品。取上述粗品，按質(zhì)量比1:100復(fù)溶于蒸飽水中。向溶液中加入耐熱型α -淀粉酶(購(gòu)自丹麥諾維信公司，型號(hào)BAN480L)至6000U/L，70°C水浴lh，期間不停攪拌。反應(yīng)結(jié)束后放入-80°C冰箱中速凍，然后取出于室溫融化，再離心，取上清液，重復(fù)這一步驟3次。將所得溶液置于透析袋中進(jìn)行透析，相對(duì)截留分子量為3500D，透析48h。之后，加入3倍溶液體積的無(wú)水乙醇，20°C靜置沉淀24h。離心，收集沉淀，冷凍干燥，即制得鐵皮石斛多糖純品。得率彡55%，純多糖中中性糖含量彡82%，淀粉含量< 0.01%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種鐵皮石斛多糖的純化方法，其特征在于步驟如下: (1)原料:以鐵皮石斛干品為原料； (2)粉碎:用粉碎機(jī)將鐵皮石斛干品進(jìn)行粉碎； (3)過(guò)篩:粉碎后的原料進(jìn)行分級(jí)過(guò)篩60-80目； (4)脫脂:將石斛粗粉用10-20倍有機(jī)溶劑回流2-4次進(jìn)行脫脂，之后離心分離，去除有機(jī)溶劑，收集藥渣； (5)水提:向藥渣中加入20-40倍蒸餾水，在70°C溫度下進(jìn)行水提，將上述水提液進(jìn)行抽濾，獲得濾液，并重復(fù)水提3-4次，合并濾液； (6)真空濃縮:將所得濾液進(jìn)行真空濃縮，濃縮至原有體積的1/6; (7)醇沉:向濃縮液中緩緩加入無(wú)水乙醇，邊攪拌，邊加入，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到80%時(shí)停止加入，20 °C靜置12-24h ； (8)離心分離:醇沉過(guò)夜后，將溶液進(jìn)行離心，棄去上層有機(jī)試劑，收集沉淀； (9)多糖粗品:將沉淀置于通風(fēng)處，使其中的乙醇揮發(fā)殆盡，冷凍干燥得到多糖粗品； (10)復(fù)溶:將粗多糖按質(zhì)量比1:100復(fù)溶于水，邊溶解邊攪拌，直至完全溶解； (11)向溶液中加入耐熱型α-淀粉酶反應(yīng)； (12)凍融離心:反應(yīng)結(jié)束后，待溶液冷卻即放入_80°C冰箱中速凍，然后取出在25°C環(huán)境中融化，融化后離心，收集上清液，重復(fù)這一步驟3-4次；(13)透析:將所得溶液置于透析袋中進(jìn)行透析，相對(duì)截留分子量為3500D，透析48h; (14)醇沉:透析結(jié)束后，向溶液中加入3倍溶液體積的無(wú)水乙醇，邊加入邊攪拌，20°C靜置沉淀12-24h ; (15)離心分離:醇沉過(guò)夜后進(jìn)行離心分離，去除乙醇，收集沉淀； (19)冷凍干燥:將沉淀進(jìn)行真空冷凍干燥，即制得鐵皮石斛多糖純品。2.如權(quán)利要求1所述的純化方法，其特征是:步驟(11)加入了耐熱型α-淀粉酶，并設(shè)定酶的活力濃度至6000U/L，70°C反應(yīng)l_3h。3.如權(quán)利要求1所述的純化方法，其特征是:步驟(4)所述有機(jī)溶劑為95%乙醇溶液。
【專利摘要】本發(fā)明屬于藥物成分提取領(lǐng)域，涉及鐵皮石斛多糖的純化方法，其工藝步驟是：原料，粉碎，過(guò)篩，脫脂，水提，抽濾，真空濃縮，醇沉，離心分離，粗品，復(fù)溶，除淀粉，反復(fù)超低溫速凍、融化、離心，透析，醇沉，離心分離，冷凍干燥，得石斛多糖。本發(fā)明的技術(shù)效果是：除去了淀粉，極大地提高了石斛多糖純化效率和成本，且步驟簡(jiǎn)便有效保存石斛多糖生物活性。
【IPC分類】C08B37/00
【公開號(hào)】CN104892783
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510237026
【發(fā)明人】聶少平, 黃曉君, 張冠亞, 崔武衛(wèi), 田芳
【申請(qǐng)人】南昌大學(xué)
【公開日】2015年9月9日
【申請(qǐng)日】2015年5月11日