一株假交替單胞菌突變菌株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株假交替單胞菌突變菌株 Pseudoalteromonas sp. CSN423-M 及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 蛋白酶是世界三大工業(yè)用酶之一，占世界酶類銷售總額的60%，在食品、醫(yī)藥、制 革、洗滌劑、廢物處理等領(lǐng)域都有很好的應(yīng)用前景，且廣泛分布于植物、動(dòng)物和微生物中，微 生物源蛋白酶較動(dòng)植物源蛋白酶有顯著優(yōu)勢，如來源廣、生產(chǎn)周期短、產(chǎn)量高、高產(chǎn)菌株易 于選育、下游處理技術(shù)相對簡單，易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)等，因此，微生物源蛋白酶成為研宄 的熱點(diǎn)。目前芽孢桿菌是工業(yè)化生產(chǎn)蛋白酶的主要菌種。
[0003] 海洋微生物源蛋白酶具有獨(dú)特的酶學(xué)性質(zhì)，日益引起人們的關(guān)注，如海洋微生物 產(chǎn)生的蛋白酶在高鹽濃度條件下仍具有較高的催化活力，可滿足那些高鹽條件下酶催化反 應(yīng)受抑制的工業(yè)化生產(chǎn)要求。深海嗜壓微生物是嗜壓酶重要來源，高壓增加了酶活性和熱 穩(wěn)定性，且使酶具有良好的立體專一性。利用海洋微生物開發(fā)的酶制劑，最適催化溫度接近 自然環(huán)境，不僅降低了生產(chǎn)過程中的能耗，而且使工藝流程簡單化，在工業(yè)上有著良好的應(yīng) 用前景。
[0004] 然而從自然界分離到的菌株產(chǎn)酶活力一般都很低，要實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)、低耗和優(yōu)質(zhì)的高 效轉(zhuǎn)化，則需進(jìn)行定向或非定向性菌種改良，以期突破或解除微生物代謝調(diào)控，獲得蛋白酶 高產(chǎn)菌株以滿足工業(yè)化生產(chǎn)需求，這將具有十分顯著的經(jīng)濟(jì)效益和深遠(yuǎn)的社會效益。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一株高產(chǎn)胞外蛋白酶的假交替單胞菌突變菌株及其應(yīng)用。
[0006] 一株假交替單胞菌突變菌株，分類命名為Pseudoalteromonas sp. CSN423-M，該菌 于2015年1月9日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)，地址：中國湖北省武漢市武 漢大學(xué)，保藏編號為CCTCC No. M 2015024。
[0007] 所述假交替單胞菌突變菌株（Pseudoalteromonas sp. CSN423-M)由分離自渤海海 域的菌株假交替單胞菌Pseudoalteromonas sp. CSN423經(jīng)紫外誘變選育。
[0008] 假交替單胞菌突變菌株CSN423-M經(jīng)菌落形態(tài)鑒定：該菌在平板上培養(yǎng)24h后的 菌落呈白色，圓形，表面光滑不透明，邊緣整齊；革蘭氏染色為陰性，菌體桿狀，無鞭毛，無莢 膜。
[0009] 假交替單胞菌突變菌株CSN423-M經(jīng)生理生化測定，氧化酶試驗(yàn)為陽性，脲酶試驗(yàn) 為陰性，接觸酶試驗(yàn)為陽性，卵磷脂酶實(shí)驗(yàn)為陽性；能水解明膠、淀粉、纖維素；甲基紅試驗(yàn) 為陰性，V-P試驗(yàn)為陰性，H 2S實(shí)驗(yàn)為陽性，硝酸鹽還原測定為陽性、亞硝酸鹽還原測定陽性。 生長溫度范圍4~30°C。
[0010] 該菌的16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0011] 該菌株能夠產(chǎn)胞外蛋白酶，具有水解蛋白的功能，經(jīng)測定，該菌培養(yǎng)96h后，蛋白 酶活性達(dá)1461. 33U/mL，可用于蛋白酶的工業(yè)化生產(chǎn)，對蛋白酶的研宄和利用具有重要價(jià) 值。
【附圖說明】
[0012] 圖1.假交替單胞菌突變菌株CSN423-M的掃描電鏡照片（80000倍）；
[0013] 圖2.假交替單胞菌突變菌株CSN423-M及部分相關(guān)菌株依據(jù)16S rDNA序列構(gòu)建 的系統(tǒng)發(fā)育樹；
[0014] 圖3.平板透明圈法篩選蛋白酶高產(chǎn)菌株；
[0015] 圖4.發(fā)酵培養(yǎng)的假交替單胞菌CSN423與突變菌株CSN423-M胞外蛋白酶酶譜活 性電泳圖；
[0016] 圖5.發(fā)酵培養(yǎng)不同時(shí)間的假交替單胞菌CSN423與突變菌株CSN423-M產(chǎn)胞外蛋 白酶活性。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 以下結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但不對本發(fā)明構(gòu)成任何限 定。以下實(shí)施例中除特殊說明外，均為本領(lǐng)域常規(guī)試劑和方法步驟。
[0018] 實(shí)施例1通過紫外誘變的方法獲得假交替單胞菌突變菌株CSN423-M。
[0019] 紫外誘變的出發(fā)菌株假交替單胞菌CSN423,分離自渤海海域。
[0020] SL制備菌懸液
[0021] 取已活化的假交替單胞菌CSN423接種于液體2216E培養(yǎng)基，15°C，200rpm，培養(yǎng)至 對數(shù)期，8000rpm離心10min，收集菌體，用0. 85%無菌生理鹽水離心洗滌2次后，制成菌懸 液，用顯微鏡直接記數(shù)法，調(diào)整菌液濃度為IX 108CFU/mL。
[0022] S2.紫外誘變
[0023] 采用波長253. 4nm，功率為20w的紫外燈，照射距離40cm，在無菌工作臺進(jìn)行誘變。
[0024] 取2mL制備好的菌懸液，于直徑6cm的無菌培養(yǎng)皿中，置于磁力攪拌器上攪拌，開 啟紫外燈，照射一定時(shí)間。
[0025] S3.平板透明圈法進(jìn)行蛋白酶高產(chǎn)菌株篩選
[0026] 將紫外誘變后的菌液涂布脫脂奶粉平板，以未誘變菌株為對照，15°C，避光培養(yǎng) 48h，挑取透明圈直徑與菌落直徑比值較大的菌株。結(jié)果見圖3。
[0027] 實(shí)施例2假交替單胞菌突變菌株CSN423-M的生物學(xué)性狀及生理生化和分子鑒定
[0028] SI.形態(tài)特征：假交替單胞菌突變菌株CSN423-M在掃描電鏡下的形態(tài)見圖1，該假 交替單胞菌突變菌株CSN423-M在平板上培養(yǎng)24h后的菌落呈白色，圓形，表面光滑不透明， 邊緣整齊；革蘭氏染色為陰性，菌體桿狀，無鞭毛，無莢膜。
[0029] S2.生理生化特征：經(jīng)生理生化測定，本發(fā)明的假交替單胞菌突變菌株CSN423-M 的氧化酶試驗(yàn)為陽性，脲酶試驗(yàn)為陰性，接觸酶試驗(yàn)為陽性，卵磷脂酶實(shí)驗(yàn)為陽性；能水解 明膠、淀粉、纖維素；甲基紅試驗(yàn)為陰性，V-P試驗(yàn)為陰性，H 2S實(shí)驗(yàn)陽性，硝酸鹽還原測定為 陽性、亞硝酸鹽還原測定陽性。生長溫度范圍4~30°C，見表1。
[0030] 表1假交替單胞菌突變菌株CSN423-M生理生化特征
[0031]
[0033] S3.假交替單胞菌突變菌株CSN423-M 16S rDNA的序列測定與分析
[0034] S31. PCR模板DNA的快速制備：將假交替單胞菌突變菌株CSN423-M劃線接種在 2216E培養(yǎng)基的平板上，15°C培養(yǎng)過夜。取單一菌落懸浮于IOmL CldH2O中，沸水浴加熱5min， 離心，取上清作為PCR模板DNA。
[0035] S32. 16S rDNA 基因 PCR 擴(kuò)增
[0036] PCR引物由華大基因合成。
[0037] Primer A :5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'
[0038] Primer B :5' -ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3，
[0039] PCR反應(yīng)體系如下：
[0040]
[0041] PCR 擴(kuò)增條件：95°C 3min，95°C 30s，55°C lmin，72°C 90s，30 個(gè)循環(huán)；72°C lOmin。
[0042] 序列測定：PCR產(chǎn)物純化后，送華大基因測序，其序列如SEQ ID NO: I所示。該序 列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的已知序列進(jìn)行BLAST比較分析，并從數(shù)據(jù)庫獲得相關(guān)種屬的16S rDNA序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖2。經(jīng)比較分析發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的假交替單胞菌突變菌株 CSN423-M與菌株（Pseudoalteromonas arctica A 37-1-2)親緣關(guān)系最近，假交替單胞菌突 變菌株 CSN423-M 的 16S rDNA 序列與 Pseudoalteromonas arctica A 37-1-2 有 99%的同 源性。
[0043] 綜合16S rDNA序列分析、生理生化特性分析，表明本發(fā)明屬于假交替單胞菌，命名 為假交替單胞菌Pseudoalteromonas sp.CSN423_M，該菌于2015年1月9日保藏于中國典 型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)，保藏編號為CCTCC No. M 2015024。
[0044] 實(shí)施例3假交替單胞菌突變菌株CSN423-M產(chǎn)胞外蛋白酶活力測定
[0045] 將平板透明圈法篩選出的胞外蛋白酶高產(chǎn)菌株假交替單胞菌突變菌株CSN423-M 接種于2216E液體培養(yǎng)基，15°C，200rpm培養(yǎng)24h，按2%接種量接種發(fā)酵培養(yǎng)基，15°C， 200rpm振蕩培養(yǎng)120h，每隔24h取發(fā)酵液，SOOOrpm離心除菌體，上清即為粗酶液，然后以酪 蛋白為底物進(jìn)行胞外蛋白酶酶譜活性電泳（何海倫，【申請?zhí)枴?01310018497. 5)，見圖4,圖 中顯示假交替單胞菌突變菌株CSN423-M所產(chǎn)胞外蛋白酶較誘變出發(fā)菌CSN423產(chǎn)胞外蛋白 酶活性顯著增強(qiáng)，且產(chǎn)酶時(shí)間提前。
[0046] Folin-酚法測定蛋白酶活力（張樹政，1998):用20mM Tris-HCl pH 7. 8將酶液 稀釋合適的倍數(shù)，取200 μ L稀釋好的酶液，在40°C下保溫2min，加入同樣溫度的200 μ L 2%酪蛋白，40°〇反應(yīng)1011^11，加入40(^1^0.4]\1的三氯乙酸終止反應(yīng)，9000\8離心101^11， 取30 μ L上清液加入150 μ L 0. 4Μ的碳酸鈉，混勻后加入30 μ L Folin-酚試劑，混勻后反 應(yīng)20min，在660nm波長下測定吸光度，標(biāo)準(zhǔn)曲線用不同濃度的酪氨酸來制定。
[0047] 酶活力單位定義：
[0048] 在40°C，每分鐘催化酪蛋白水解生成1 μ g酪氨酸的所需酶量定義為1個(gè)活性單位 ⑶。
[0049] 測試結(jié)果發(fā)現(xiàn)，假交替單胞菌突變菌株CSN423-M培養(yǎng)96h后蛋白酶活力可以達(dá)到 1461. 33U/mL，較誘變出發(fā)菌株假交替單胞CSN423提高342 %，且產(chǎn)酶時(shí)間提前，見圖5,此 結(jié)果與活性電泳結(jié)果一致，該菌株在工業(yè)化應(yīng)用中不僅可以降低生產(chǎn)過程中的能耗，而且 使工藝流程簡單化，可有效節(jié)約成本。
[0050] 2216E 液體培養(yǎng)基（g/100mL):蛋白胨 0. 5g，酵母 0. lg，F(xiàn)e2(P04)30 . 001g，人工海水 10OmT,, pH 7. 8〇
[0051] 篩選培養(yǎng)基（g/l〇〇mL):蛋白胨0. 5g，酵母0. lg，F(xiàn)e2(P04)30. 001g，脫脂奶粉lg，瓊 脂粉2g，人工海水100mL，pH 7. 8。
[0052] 發(fā)酵培養(yǎng)基（g/100mL):玉米粉 2g，麩皮 lg，豆柏 2g，Na2HPO4O. lg，KH2PO40.0 3g， CaCl2O. lg，Na2CO3O. lg，人工海水 100mL，pH 7· 8。
[0053] 經(jīng)平板透明圈法初篩和發(fā)酵培養(yǎng)后進(jìn)行蛋白酶活力測定，篩選出產(chǎn)蛋白酶 活力最高的菌株，經(jīng)過形態(tài)學(xué)及生理生化和DNA鑒定后，命名為Pseudoalteromonas sp. CSN423-M，簡稱假交替單胞菌CSN423-M。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一株假交替單胞菌突變菌株P(guān)seudoalteromonassp.CSN423-M，保藏編號為CCTCC No.M2015024。2. 權(quán)利要求1所述的假交替單胞菌突變菌株在蛋白水解中的應(yīng)用。3. 權(quán)利要求1所述的假交替單胞菌突變菌株在生產(chǎn)胞外蛋白酶中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體公開了一株假交替單胞菌突變菌株P(guān)seudoalteromonas sp.CSN423-M及其應(yīng)用。所述Pseudoalteromonas sp.CSN423-M菌株已于2015年1月9日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCC No.M2015024。該菌株的16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本發(fā)明的假交替單胞菌CSN423-M能夠產(chǎn)胞外蛋白酶，經(jīng)測定，該菌培養(yǎng)96h后，胞外蛋白酶活性達(dá)1461.33U/mL，因此,可用于生產(chǎn)蛋白酶，對蛋白酶的研究和利用具有重要的價(jià)值。CCTCC No.M201502420150109
【IPC分類】C12P21/06, C12N1/20, C12N9/52, C12R1/01
【公開號】CN104894024
【申請?zhí)枴緾N201510317461
【發(fā)明人】何海倫, 武翠玲, 楊興昊, 劉丹, 張姜, 吳日幫, 黃雅雯
【申請人】中南大學(xué)
【公開日】2015年9月9日
【申請日】2015年6月11日