抗hiv-1活性的多肽cj130及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種抗Hiv-I活性的多肽CJ130及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 人免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus，HIV)是引起人類獲得性免疫 缺陷綜合征（Acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)的病原體。自 1981 年美國首 次發(fā)現(xiàn)以來，艾滋病在全球范圍內(nèi)迅速傳播。2014年7月UNAIDS的最新報(bào)告顯示，全球HIV 感染人數(shù)已達(dá)3500萬，2013年，中國新診斷HIV感染者63498例，估計(jì)中國目前存活的HIV 感染者78萬人。
[0003] 目前將幾種抗病毒治療藥物聯(lián)合使用的高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療聯(lián)合療法（Highly Active Anti-Retroviral Therapy，HAART)，極大的降低了 HIV患者體內(nèi)的病毒載量，延緩 了疾病進(jìn)程。然而，截止到目前，艾滋病依然無法治愈。隨著抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物的廣泛應(yīng)用， 耐藥性問題日益凸顯。而且，由于該方法不能完全清除病毒，病人需要終身服藥，但長期用 藥具有嚴(yán)重毒副作用。鑒于這些問題，研宄和開發(fā)針對新靶點(diǎn)的抗HIV藥物就顯得尤為緊 迫。
[0004] HIV全基因組約有9700個(gè)堿基，由結(jié)構(gòu)蛋白基因、調(diào)控元件與調(diào)節(jié)蛋白基因和輔 助蛋白基因組成。HIV 的輔助蛋白包括 Vif (virion infectivity factor)、Nef (negative factor)、Vpr (viral protein R)與 Vpu (viral protein U)〇

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種抗HIV-I活性的多肽CJ130及其應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明提供了一種多肽，命名為多肽CJ130,為序列表的序列1所示的多肽。
[0007] 本發(fā)明還保護(hù)多肽CJ130在制備抗HIV藥物中的應(yīng)用。所述HIV可為HIV-1，具體 可為HIV-IB亞型，更具體可為pNL4. 3野生株。
[0008] 本發(fā)明還保護(hù)一種抗HIV的藥物，其活性成分為多肽CJ130。所述HIV可為HIV-1， 具體可為HIV-IB亞型，更具體可為pNL4. 3野生株。
[0009] pNL4. 3野生株的制備過程具體如下：將PNL4. 3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，在CO2培養(yǎng)箱 中37°C培養(yǎng)36小時(shí)，收集上清，該上清即為病毒液。
[0010] Vpu蛋白是HIV-I所特有的輔助調(diào)節(jié)蛋白，由77-86個(gè)氨基酸組成，相對分子質(zhì)量 約為9kDa，是一種跨膜蛋白。Vpu蛋白的功能主要是降解HIV受體蛋白CD4分子和細(xì)胞天然 抗病毒蛋白Tetherin因子，促進(jìn)新生病毒顆粒從被感染細(xì)胞的質(zhì)膜上釋放。研宄顯示，Vpu 蛋白變異或其功能受到抑制時(shí)，HIV-I病毒顆粒的產(chǎn)生會(huì)明顯減少，表明Vpu蛋白對HIV-I 病毒復(fù)制至關(guān)重要。這也提示Vpu蛋白可作為抗HIV藥物研發(fā)的新靶點(diǎn)。HIV調(diào)控蛋白必 須與特定的細(xì)胞因子結(jié)合才能發(fā)揮作用。由于HIV具有高度變異性，而細(xì)胞基因的復(fù)制相 對精確，因此本發(fā)明創(chuàng)造性的使用來源于Vpu蛋白的多肽，利用其競爭性的阻斷Vpu與相關(guān) 細(xì)胞蛋白作用的位點(diǎn)，從而研宄新的抗HIV藥物，并有效的防止出現(xiàn)耐藥性。這可能為艾滋 病治愈帶來新的希望。
[0011] 本發(fā)明對于艾滋病的治療具有重大價(jià)值。
【具體實(shí)施方式】
[0012] 以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平 均值。
[0013] TC50代表半數(shù)毒性濃度，即50%細(xì)胞出現(xiàn)毒性時(shí)的藥物濃度，利用GraphPad Prism 6軟件計(jì)算的得到TC50值。IC50代表半數(shù)抑制濃度，即藥物抑制50%病毒復(fù)制時(shí)的 濃度，利用GraphPad Prism 6軟件計(jì)算的得到IC50值。
[0014] pNL4. 3質(zhì)粒：公眾可以從中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研宄所獲 得；參考文獻(xiàn)：Wang C, Mitsuya Y, Gharizadeh B, Ronaghi M, Shafer Rff. Characterization of mutation spectra with ultra-deep pyrosequencing:application to HIV-I drug resistance. Genome research 2007;17:1195-201. ;pNL4.3 質(zhì)粒含有 HIV-1B 亞型野生株 的全基因組序列，轉(zhuǎn)染細(xì)胞并表達(dá)可以得到HIV-IB亞型pNL4. 3野生株。
[0015] HIV-IB亞型pNL4. 3野生株簡稱pNL4. 3病毒。pNL4. 3病毒由pNL4. 3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 293T細(xì)胞表達(dá)獲得。pNL4. 3病毒的制備過程如下：用含體積百分比為10%的胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)基懸浮293T細(xì)胞，得到4 X IO5個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液加入6孔培養(yǎng) 板（每孔2ml)，在0)2培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)24小時(shí)；采用Lipofectamine 2000試劑盒（按 說明書操作）將PNL4. 3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞（每孔轉(zhuǎn)染4微克pNL4. 3質(zhì)粒），在0)2培養(yǎng) 箱中37°C培養(yǎng)36小時(shí)，收集上清（將上清用HIV-1P24抗原檢測試劑盒進(jìn)行P24抗原測定， 結(jié)果為陽性），該上清即為PNL4. 3病毒的病毒液，分裝后-80°C保存。
[0016] 293T細(xì)胞（人胚腎傳代細(xì)胞系）：參考文獻(xiàn)：Li H，Geng Q，Guo W，Zhuang D，Li L，Liu Y，Bao Z，Liu S，Li J. Screening for and verification of novel mutations associated with drug resistance in the HIV type I subtype Bi in China. Plos One 2012 ;7:e47119.。
[0017] HIV-I P24抗原檢測試劑盒：河北醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程中心。
[0018] MT-2細(xì)胞（傳代人T淋巴細(xì)胞系）：參考文獻(xiàn)：劉思揚(yáng)，莊道民，董如華，白 麗，李敬云.兩種HIV非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥病毒株的體外選擇和鑒定.藥學(xué)學(xué) 報(bào)· 2010, 45(2) :241-246.。
[0019] TZM-bl細(xì)胞（也稱JC57BL-13細(xì)胞，來源于HeLa細(xì)胞系）：參考文獻(xiàn)："孫堅(jiān)萍， 馬麗英，黃江虹，余小玲，徐維灑，紀(jì)燕，黃洋，邵一鳴.TZM-bl細(xì)胞系檢測我國HIV-I 病毒表型耐藥性.中國艾滋病性病雜志.2008 ; 14(5) :439-449.。
[0020] Lysis Buffer :20ml Triton X-100、230ml 蒸餾水、250ml 甘油和 500ml Tris-HCl 緩沖液（1M, ρΗ7· 8)混合。FluorAce Working Solution :96 μ I IOOmM MUG 溶液（MUG，全稱 為 4-Methylumbelliferyl β -D-galactopyranoside，分子式為 C16H1808;MUG 溶液用 DMSO 配 制）、10ml Lysis Buffer、6ml蒸餾水和15 μ 1 β -巰基乙醇混合。終止液：IM甘氨酸水溶 液，用10Μ NaOH水溶液調(diào)整pH值至14,4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0021] 實(shí)施例1、多肽的制備
[0022] 本發(fā)明的發(fā)明人設(shè)計(jì)了多肽CJ130,其氨基酸序列如下：
[0023] 多肽 CJ130 (序列表的序列 I) :VWSIVIIEYRKILRQRKIDRRRRRRRRRR。
[0024] 人工合成多肽CJ130。
[0025] 實(shí)施例2、多肽的毒性測定
[0026] 1、將Img實(shí)施例1制備的多肽CJ130溶于20 μ I DMSO,然后用DMSO進(jìn)行2倍梯度 稀釋，得到含有不同濃度的多肽的各個(gè)多肽稀釋液。
[0027] 2、取白色透明96孔板上，加入步驟1制備的多肽稀釋液（每孔1 μ 1)。
[0028] 3、用含體積百分比為10%的胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液懸浮ΜΤ-2細(xì)胞，得到 I. 5 X IO5個(gè)細(xì)胞/ml的ΜΤ-2細(xì)胞懸液。
[0029] 4、取步驟3得到的MT-2細(xì)胞懸液，加至完成步驟2的96孔板上（每孔200 μ 1)， 瞬時(shí)離心，然后37°C、5% CO2培養(yǎng)72小時(shí)。
[0030] 5、完成步驟 4 后，取所述 96 孔板，每孔加入 20 μ ICellTiter- .Glo' Luminescent Cell Viability Assay(CellTiter-'Glo?:發(fā)光法細(xì)胞活力檢測試劑盒），通過Wallac 1420 讀數(shù)儀測定發(fā)光信號(hào)（ATP是活細(xì)胞新陳代謝的一個(gè)指標(biāo)，通過對ATP進(jìn)行定量測定來檢測 培養(yǎng)物中活細(xì)胞數(shù)目）。
[0031] 多肽 CJ130 的 TC50 值為 11·69μΜ。
[0032] 試驗(yàn)結(jié)果表明，多肽對ΜΤ2細(xì)胞有一定程度的毒性。
[0033] 實(shí)施例3、多肽的抗HIV-I活性測定
[0034] 1、將Img實(shí)施例1制備的多肽CJ130溶于20 μ I DMS0,然后用DMSO進(jìn)行2倍梯度 稀釋，得到含有不同濃度的多肽的各個(gè)多肽稀釋液。
[0035] 2、取白色透明96孔板上，加入步驟1制備的多肽稀釋液（每孔1 μ 1)
[0036] 3、用含體積百分比為10%的胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液懸浮ΜΤ-2細(xì)胞，得到 3. OX IO5個(gè)細(xì)胞/ml的ΜΤ-2細(xì)胞懸液。
[0037] 4、用含體積百分比為10%的胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整pNL4. 3病毒的病毒 液中的病毒濃度，得到400TCID50/ml的病毒稀釋液。
[0038] 5、將步驟3得到的MT-2細(xì)胞懸液與步驟4得到的病毒稀釋液等體積混合，然后將 混合液加至完成步驟2的96孔板上（每孔200 μ 1)，瞬時(shí)離心，然后37°C、5% CO2培養(yǎng)72 小時(shí)，收集培養(yǎng)上清。
[0039] 6、用含體積百分比為10 %的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液懸浮TZM-bl細(xì)胞，得到 3X IO5個(gè)細(xì)胞/ml的TZM-bl細(xì)胞懸液。
[0040] 7、將步驟6得到的TZM-bl細(xì)胞懸液加入黑色96孔板（每孔40 μ 1)。
[0041] 8、完成步驟7后，取所述黑色96孔板，每孔加入20 μ 1步驟5得到的培養(yǎng)上清，瞬 時(shí)離心，然后37°C、5% CO2培養(yǎng)24小時(shí)。
[0042] 9、完成步驟8后，每孔加入30 μ I FluorAce Working Solution，繼續(xù)孵育2小 時(shí)，然后加入10 μ 1終止液，用Wallac 1420讀數(shù)儀測定β -gal基因的表達(dá)（TZM-bl細(xì)胞 被HIV-I感染后表達(dá)的Tat蛋白可以激活LTR控制下的β -gal報(bào)告基因的表達(dá)，其表達(dá)量 與感染的HIV-I的量成正比，通過檢測報(bào)告基因的表達(dá)水平，就可以評價(jià)藥物的抗病毒效 果）。
[0043] 多肽 CJ130 的 IC50 值為 3· 75 μ Μ。
[0044] 試驗(yàn)結(jié)果表明，多肽對HIV-pNL4. 3野生型病毒株具有抑制活性。
[0045] 綜合實(shí)施例2和實(shí)施例3的結(jié)果，得到治療指數(shù)，即TI值（TI = TC50/IC50)。多 肽CJ130的治療指數(shù)為3. 118997。
[0046] 本發(fā)明提供了多肽的臨床前藥效數(shù)據(jù)，為其進(jìn)一步研宄和上市提供參考。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 序列表的序列1所示的多肽。2. 權(quán)利要求1所述多肽在制備抗HIV藥物中的應(yīng)用。3. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于：所述HIV為HIV-I。4. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于：所述HIV為HIV-IB亞型。5. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于：所述HIV為pNL4. 3野生株。6. -種抗HIV的藥物，其活性成分為權(quán)利要求1所述多肽。7. 如權(quán)利要求6所述的藥物，其特征在于：所述HIV為HIV-I。8. 如權(quán)利要求6所述的藥物，其特征在于：所述HIV為HIV-IB亞型。9. 如權(quán)利要求6所述的藥物，其特征在于：所述HIV為pNL4. 3野生株。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抗HIV-1活性的多肽CJ130及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種多肽，命名為多肽CJ130，為序列表的序列1所示的多肽。本發(fā)明還保護(hù)多肽CJ130在制備抗HIV藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還保護(hù)一種抗HIV的藥物，其活性成分為多肽CJ130。本發(fā)明對于艾滋病的治療具有重大價(jià)值。
【IPC分類】C07K14/16, A61K38/16, A61P31/18
【公開號(hào)】CN104910261
【申請?zhí)枴緾N201510362883
【發(fā)明人】李林, 李敬云, 常帥, 蔡利鋒, 李天一, 李韓平, 鮑作義, 劉永健, 劉思揚(yáng), 莊道民, 王曉林
【申請人】中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所
【公開日】2015年9月16日
【申請日】2015年6月26日