胺吡喃葡萄糖（MAG):鹽酸葡萄糖胺與甲基丙烯酰氯在含碳 酸鉀的甲醇溶液中反應(yīng)后，對沉淀物進(jìn)行純化得到單體MG ; (2) 制備聚合物：控制單體對苯乙烯磺酸鈉（SS)及MAG在水與DMF混合溶劑中的比例， 利用RAFT方法聚合分別得到均聚物pSS、pMG及共聚物pSG。
[0025] 實(shí)施例一 (1》制備單體2-甲基丙烯酰胺吡喃葡萄糖（MAG):鹽酸葡萄糖胺與甲基丙烯酰氯在含碳 酸鉀的甲醇溶液中冰浴條件下反應(yīng)3至4小時(shí)，之后抽濾并旋蒸得到沉淀物，并對沉淀物進(jìn) 行提純及干燥，得到單體MAG。
[0026] (2)選取SS與MG為單體，在H20/DMF (1/1)混合溶劑中進(jìn)行RAFT聚合，調(diào)節(jié)單體 初始投料比分別得到均聚物pSS、pMG與共聚物pSG。
[0027] (3)通過核磁與紅外對所得聚合物進(jìn)行表征。
[0028] 結(jié)果如圖1-3所示，聚合物pSG的IH-NMR譜圖和FT-IR譜圖。
[0029] 將聚合物分子用于促進(jìn)胚胎干細(xì)胞體外增殖，包括以下步驟： (1)將胚胎干細(xì)胞種于預(yù)先鋪滿明膠的培養(yǎng)板上，并在分別含有三種聚合物的培養(yǎng)液 中培養(yǎng)20天； (2》對培養(yǎng)20天后的細(xì)胞進(jìn)行MTT測試，表征在含不同聚合物的培養(yǎng)環(huán)境下細(xì)胞增殖 情況，并對其進(jìn)行比較。
[0030] 實(shí)施例二 (1)將胚胎干細(xì)胞種于預(yù)先鋪滿明膠的培養(yǎng)板上，加入分別含有1 μ g/mL的三種聚合物 或肝素的干細(xì)胞培養(yǎng)液環(huán)境中培養(yǎng)10天與20天。
[0031] (2)棄去培養(yǎng)物中溶液，用含有3- (4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑 溴鹽（MTT)的細(xì)胞培養(yǎng)液處理胚胎干細(xì)胞4小時(shí)，吸去MTT細(xì)胞培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜 (DMSO)，溶解活細(xì)胞中生成的甲瓚晶體。
[0032] (3)將溶解有甲瓚晶體的DMSO溶液轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)板中，在酶標(biāo)儀上于490nm讀 取各孔吸光值。
[0033] 結(jié)果如圖4所示，胚胎干細(xì)胞分別在含有所得聚合物的培養(yǎng)液環(huán)境中培養(yǎng)10天及 20天后增殖行為情況。
[0034] 將聚合物分子用于促進(jìn)胚胎干細(xì)胞體外定向神經(jīng)分化，包括以下步驟： (1》將胚胎干細(xì)胞種于預(yù)先鋪滿明膠的培養(yǎng)板上，并在分別含有三種聚合物的培養(yǎng)液 中培養(yǎng)20天； (Z)對培養(yǎng)20天后的細(xì)胞進(jìn)行β Ill-tubulin免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)，通過圖像定性比較 在含不同聚合物的培養(yǎng)環(huán)境下細(xì)胞神經(jīng)定向分化情況。
[0035] (3)對培養(yǎng)20天后的細(xì)胞進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，定量比較在含不同聚合物的培 養(yǎng)環(huán)境下細(xì)胞神經(jīng)定向分化情況。
[0036] 實(shí)施例三 (1》將胚胎干細(xì)胞種于預(yù)先鋪滿明膠的培養(yǎng)板上，加入分別含有1 μ g/mL的聚合物的干 細(xì)胞培養(yǎng)液環(huán)境中培養(yǎng)20天。
[0037] ⑵吸除原培養(yǎng)液，用4%多聚甲醛溶液、0. 1% Triton X-100/PBS溶液及3%牛血清 白蛋白（BSA)溶液依次對細(xì)胞進(jìn)行固定、破膜及封閉處理，之后，利用含有神經(jīng)分化標(biāo)志物 β Ill-tubulin的特異性抗體對細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色處理。利用DAPI試劑對細(xì)胞核進(jìn)行 染色。利用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞分化情況。
[0038] (3)利用RNA全提取試劑盒提取培養(yǎng)20天后的細(xì)胞中全部RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ) DNA。利用stepon印Ius實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)對其進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)。
[0039] 結(jié)果如圖3所示。
[0040] 如圖5和圖6所示，胚胎干細(xì)胞在分別含有三種聚合物或肝素的培養(yǎng)液環(huán)境中培 養(yǎng)20天后的神經(jīng)分化情況。
[0041] 圖5是qPCR定量分析分別經(jīng)過聚合物pSS、PSG與肝素培養(yǎng)的胚胎干細(xì)胞 β Ill-tubulin基因表達(dá)量； 圖6是分別經(jīng)過聚合物培養(yǎng)的胚胎干細(xì)胞熒光染色圖（綠色：β Ill-tubulin ;藍(lán)色： DAPI)(標(biāo)尺：25 μm);圖中藍(lán)色代表細(xì)胞核，綠色代表神經(jīng)分化標(biāo)記蛋白β 3-tubulin的 表達(dá)情況，圖中綠色區(qū)域越多，表明β 3-tubulin蛋白的表達(dá)量越大，神經(jīng)分化程度越高。 可以看出，培養(yǎng)基中含共聚物PSG的細(xì)胞出現(xiàn)了神經(jīng)絲，表明pSG對胚胎干細(xì)胞神經(jīng)分化的 良好促進(jìn)作用，這種作用比肝素還高。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種新型糖胺聚糖類似物，其特征在于：將對苯己締橫酸鋼單體或/和2-甲基丙締 酷胺化喃葡萄糖單體按照一定比例添加到混合溶劑中，所述混合溶劑為水與氮氮二甲基甲 酷胺的混合物，利用可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚合的方法聚合分別得到若干種不同比例的對 苯己締橫酸鋼單體或/和2-甲基丙締酷胺化喃葡萄糖單體的聚合物。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的糖胺聚糖類似物，其特征在于；所述聚合物可W為： 2-甲基丙締酷胺化喃葡萄糖單體的均聚物； 對苯己締橫酸鋼單體的均聚物； 對苯己締橫酸鋼單體和2-甲基丙締酷胺化喃葡萄糖單體按照0. 5-4:1的摩爾比聚合 形成的共聚物。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的糖胺聚糖類似物，其特征在于：所述聚合物的分子式為：4. 一種如權(quán)利要求1或2所述新型糖胺聚糖類似物的合成方法，其特征在于，包括W下 步驟： 制備2-甲基丙締酷胺化喃葡萄糖單體：將鹽酸葡萄糖胺與甲基丙締酷氯在含碳酸鐘 的甲醇溶液中反應(yīng)后，對沉淀物進(jìn)行純化得到2-甲基丙締酷胺化喃葡萄糖單體； :丑;制備聚合物；控制對苯己締橫酸鋼單體及2-甲基丙締酷胺化喃葡萄糖單體在混合 溶劑中的比例，所述混合溶劑為水與氮氮二甲基甲酯胺的混合物，利用可逆加成-斷裂鏈 轉(zhuǎn)移聚合方法聚合分別得到若干種不同比例的對苯己締橫酸鋼單體或/和2-甲基丙締酷 胺化喃葡萄糖單體的聚合物。5. -種使用如權(quán)利要求2所述的糖胺聚糖類似物的促進(jìn)胚胎干細(xì)胞體外增殖或體外 定向神經(jīng)分化的應(yīng)用方法，其特征在于，包括W下步驟；分別向種有胚胎干細(xì)胞的若干個(gè)培 養(yǎng)板內(nèi)各倒入一種含有所述聚合物的培養(yǎng)液，培養(yǎng)若干天。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于；所述培養(yǎng)板預(yù)先鋪滿明膠。
【專利摘要】新型糖胺聚糖類似物及其合成方法及其在體外胚胎干細(xì)胞增殖及定向神經(jīng)分化中的應(yīng)用方法,其特征在于：將對苯乙烯磺酸鈉單體或/和2-甲基丙烯酰胺吡喃葡萄糖單體按照一定比例添加到混合溶劑中，所述混合溶劑為水與氮氮二甲基甲酰胺（N,N-Dimethylformamide）的混合物，利用可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚合（RAFT）的方法聚合分別得到若干種不同比例的對苯乙烯磺酸鈉單體或/和2-甲基丙烯酰胺吡喃葡萄糖單體的聚合物。采用RAFT合成技術(shù)利用含磺酸基團(tuán)單體以及含糖單體，通過控制其相對比例調(diào)節(jié)聚合物結(jié)構(gòu)，獲得了具有體外促進(jìn)胚胎干細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其發(fā)生高效定向神經(jīng)分化的高分子物質(zhì)。
【IPC分類】C08F112/14, C08F212/14, C08F220/58, C12N5/0735, C12N5/079, C08F120/58
【公開號】CN104926976
【申請?zhí)枴緾N201510203532
【發(fā)明人】陳紅, 袁琳, 呂仲林, 陳高健, 王萌萌, 丁開國
【申請人】蘇州大學(xué)
【公開日】2015年9月23日
【申請日】2015年4月27日