一種從血粉中提取血紅素的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種提取血紅素的方法，特別涉及一種從血粉中提取血紅素的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]血紅素是一類具有重要生理功能和使用價(jià)值的天然卟啉鐵化合物，它廣泛存在于各種動(dòng)物的肌肉和血液中。血紅素在體內(nèi)參與呼吸作用以及紅細(xì)胞形成和成熟過程，并有清除體內(nèi)過氧化氫、促進(jìn)體內(nèi)抗體產(chǎn)生、催化促進(jìn)β-胡蘿卜A素轉(zhuǎn)化為維生素A等重要功能。血紅素中含有豐富的鐵，很容易被機(jī)體吸收利用，吸收率約為非血紅素鐵的五倍，因此，血紅素具有較好的抗貧血作用，也可用來作為補(bǔ)鐵劑或營(yíng)養(yǎng)增強(qiáng)劑。在食品工業(yè)上，血紅素可替代人工合成色素，保證食品的安全。另外，血紅素可輔助治療鉛中毒，而且還是制備血紅素衍生物類藥物的主要原料。
[0003]目前，血紅素的提取方法主要包括冰醋酸法和酸性丙酮法等，且多以新鮮豬血為原料進(jìn)行提取，對(duì)原料的收集、運(yùn)輸和保存等環(huán)節(jié)具有明顯的限制，不適用于工業(yè)化大生產(chǎn)。
[0004]鐘耀廣等利用冰醋酸法對(duì)血紅素的提取進(jìn)行了研宄，該方法以新鮮抗凝豬血為原料，利用冰醋酸、氯化鈉和豬血共熱得到血紅素。該方法雖然簡(jiǎn)單，但提取溫度過高，增加了生產(chǎn)成本。
[0005]酸性丙酮法是根據(jù)血紅素和珠蛋白在ρΗ=3.0時(shí)結(jié)合最疏松的原理，將血紅素與蛋白質(zhì)分離后溶于酸性丙酮，而后從酸性丙酮中提取得到血紅素粗品。宋照軍等往已吸附血紅素的酸性丙酮溶液中加入醋酸鈉，離心分離后獲得血紅素結(jié)晶；胡鑫等將已吸附血紅素的丙酮溶液進(jìn)行蒸餾使血紅素析出，并研宄了不同工藝條件對(duì)血紅素鐵得率及鐵的百分含量的影響。
[0006]冰醋酸法提取溫度高，溶劑回收困難，增加了生產(chǎn)成本，廢液處理不當(dāng)會(huì)造成環(huán)境污染。酸性丙酮法有機(jī)溶劑用量大，回收困難，且存在后續(xù)處理不便的問題。現(xiàn)有技術(shù)大多以新鮮抗凝豬血或抗凝豬血經(jīng)噴霧干燥得到的血粉作為提取血紅素的原料，明顯限制了原料收集、運(yùn)輸和保存等環(huán)節(jié)。
[0007]因此，開發(fā)一種簡(jiǎn)單、安全無污染的血紅素生產(chǎn)方法顯得尤為重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷和不足，為人們提供一種從血粉中提取血紅素的方法。
[0009]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取下述技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn):一種從血粉中提取血紅素的方法，包括以下步驟:
(I)枯草芽孢桿菌的制備:在250mL錐形瓶中，裝入10mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，接種一環(huán)已活化的枯草芽孢桿菌菌種，30°C培養(yǎng)48h后備用，此時(shí)為細(xì)菌的生長(zhǎng)對(duì)數(shù)后期或穩(wěn)定期，密度為 1.0X10-5.0XlO10 CFU/mLo
[0010](2)血粉水溶液制備:將曬干血粉與蒸餾水以1:15~1:30的比例混合，在高壓均質(zhì)設(shè)備中均質(zhì)0.5~lh，得到血粉水溶液。
[0011](3)接種、發(fā)酵液的制備:將步驟(2)得到的血粉水溶液調(diào)節(jié)pH至6~9，按1%~6%體積將步驟(I)中得到的枯草芽孢桿菌接種到步驟(2)所得的血粉水溶液，50~200rpm的轉(zhuǎn)速在25~40°C發(fā)酵6~48h，得到發(fā)酵液。
[0012](4)血紅素的獲得:離心步驟(3)得到的發(fā)酵液，3000~4000r/min，10~20min，收集上層溶液，調(diào)節(jié)pH值為3~5，使血紅素沉淀，3000~4000r/min,離心10~20min，收集沉淀，用蒸餾水和無水乙醇洗滌沉淀，烘干，即得血紅素成品。
[0013]所述步驟(2)、(3)中調(diào)節(jié)pH使用的溶液為氯化氫或氫氧化鈉稀溶液。
[0014]所述步驟(3)使用枯草芽孢桿菌發(fā)酵過程中，可產(chǎn)生含α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶等代謝產(chǎn)物，與使用單一酶制劑進(jìn)行處理相比，效率更好，同時(shí)節(jié)約成本，不需精制酶制劑。
[0015]所述方法不局限于枯草芽孢桿菌發(fā)酵制備血紅素，所有利用微生物發(fā)酵制備血紅素的方法均應(yīng)為得到本發(fā)明所述方法啟示。
[0016]有益效果:
本發(fā)明所述的一種從血粉中提取血紅素的方法，提高了血紅素的提取率，利用環(huán)保無污染的方法從血粉中提取血紅素，反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)品無毒副作用，不僅避免了污染環(huán)境、試劑毒性大和回收困難等問題，同時(shí)節(jié)約生產(chǎn)成本，提高了產(chǎn)品的安全性，并增加了對(duì)血資源的利用，解決了新鮮血液作為原料的不便之處。
【附圖說明】
[0017]圖1發(fā)酵溫度對(duì)血紅素樣品純度和提取率的影響圖2接種量對(duì)血紅素樣品純度和提取率的影響
圖3沉淀pH對(duì)血紅素樣品純度和提取率的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0018]下面通過具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)的說明，但是本發(fā)明的范圍不受這些實(shí)施例的限制。
[0019]實(shí)施例1
一種從血粉中提取血紅素的方法，步驟如下:
1)枯草芽孢桿菌的制備:在250mL錐形瓶中，裝入10mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，接種一環(huán)已活化的枯草芽孢桿菌菌種，30°C培養(yǎng)48h后備用，此時(shí)為細(xì)菌的生長(zhǎng)對(duì)數(shù)后期或穩(wěn)定期，密度為 1.0X10-5.0XlO10 CFU/mL ；
2)稱取1g血粉，加入200mL蒸餾水，均質(zhì)0.5h，得到血粉溶液；
3)用2mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)血粉溶液的pH值為9.0，按4%的量接入枯草芽孢桿菌，在30°C條件下以70rpm的轉(zhuǎn)速發(fā)酵24h后，制備發(fā)酵液；
4)將步驟2)所得發(fā)酵液3000r/min離心15min，收集上層溶液，然后用lmol/L鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH至4.0，3000r/min離心15min，將得到的沉淀以蒸飽水和無水乙醇洗滌，105°C烘箱中干燥2h，得到血紅素成品。 所述豬血血粉由桂林海源公司提供。
[0020]測(cè)定樣品純度為35%，提取率為92%，與現(xiàn)有的酶法(張亞娟，從豬血中酶法制取血紅素的研宄[J]，純度24%，提取率58% ;利用超聲波及酶解技術(shù)制備鹿血血紅素的方法[P]，純度31%，提取率72%)提取血粉中血紅素的方法相比，樣品純度和提取率均有所提高。
[0021]實(shí)施例2
一種從血粉中提取血紅素的方法，步驟如下:
1)枯草芽孢桿菌的制備:在250mL錐形瓶中，裝入10mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，接種一環(huán)已活化的枯草芽孢桿菌菌種，30°C培養(yǎng)48h后備用，此時(shí)為細(xì)菌的生長(zhǎng)對(duì)數(shù)后期或穩(wěn)定期，密度為 1.0X10-5.0XlO10 CFU/mL ；
2)稱取30g血粉，加入500mL蒸餾水，均質(zhì)lh，得到血粉溶液；
3)用2mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)血粉溶液的pH值為8.0，接入6%枯草芽孢桿菌，40°C發(fā)酵，并以120rmp的速度振蕩12h，制備發(fā)酵液；
3)將步驟2)所述發(fā)酵液3000r/min離心20min，收集上層溶液，然后用lmol/L鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH至5.0，3000r/min離心20min，將得到的沉淀以蒸餾水和無水乙醇洗滌，105°C烘箱中干燥2h，得到血紅素成品。
[0022]測(cè)定，樣品純度為31%，提取率為90%，與現(xiàn)有的酶法提取血粉中血紅素的方法相比，樣品純度和提取率均有所提高。
[0023]實(shí)施例3
一種從血粉中提取血紅素的方法，步驟如下:
1)枯草芽孢桿菌的制備:在250mL錐形瓶中，裝入10mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，接種一環(huán)已活化的枯草芽孢桿菌菌種，30°C培養(yǎng)48h后備用，此時(shí)為細(xì)菌的生長(zhǎng)對(duì)數(shù)后期或穩(wěn)定期，密度為 1.0X10-5.0XlO10 CFU/mL ；
2)稱取1g血粉，加入300mL蒸餾水，均質(zhì)0.5h，得到血粉溶液；
3)用lmol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)血粉溶液的pH值為6.0，按3%的量接入枯草芽孢桿菌，35°C條件下振蕩(轉(zhuǎn)速為10rpm)發(fā)酵48h，制備發(fā)酵液；
4)3500r/min離心lOmin，收集上層溶液，然后用lmol/L鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH至4.5，3500r/min離心lOmin，將得到的沉淀以蒸飽水和無水乙醇洗滌，105°C烘箱中干燥2h，得到血紅素成品。
[0024]測(cè)定所得樣品純度為37%，提取率為92%，與現(xiàn)有的酶法提取血粉中血紅素的方法相比，樣品純度和提取率均有所提高。
[0025]相關(guān)實(shí)驗(yàn)的探討
1、發(fā)酵溫度對(duì)血紅素樣品純度和提取率的影響
實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1，由圖1可知隨著發(fā)酵溫度的升高，血紅素樣品純度呈現(xiàn)略微下降的趨勢(shì)，其原因可能是，芽孢桿菌的適宜生長(zhǎng)溫度為30-37?，溫度升高影響了菌體和代謝產(chǎn)物的活性；而不同溫度對(duì)樣品的提取率影響不大。
[0026]2、接種量對(duì)血紅素樣品純度和提取率的影響
實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2，由圖2可知在一定范圍內(nèi)，血紅素樣品純度隨著接種量的增大而增大，當(dāng)接種量達(dá)到6%以上時(shí)，樣品純度基本不再變化，說明此條件下，菌體代謝產(chǎn)物對(duì)血粉的作用已達(dá)到飽和。樣品提取率隨著接種量的增大呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，在接種量4%時(shí)，提取率達(dá)到最大。
[0027]3、沉淀pH對(duì)血紅素樣品純度和提取率的影響
實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3，由圖3可知不同的沉淀pH對(duì)血紅素樣品純度和提取率存在一定的影響。在沉淀pH為4.0的時(shí)候，樣品純度有最大值；而提取率隨沉淀pH的增大略有提高。
[0028]綜上，本發(fā)明所述的一種從血粉中提取血紅素的方法，提高了血紅素的提取率，利用環(huán)保無污染的方法從血粉中提取血紅素，反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)品無毒副作用，不僅避免了污染環(huán)境、試劑毒性大和回收困難等問題，同時(shí)節(jié)約生產(chǎn)成本，提高了產(chǎn)品的安全性，并增加了對(duì)血資源的利用，解決了新鮮血液作為原料的不便之處。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種從血粉中提取血紅素的方法，包括以下步驟: 1)枯草芽孢桿菌的制備； 2)血粉水溶液制備； 3)接種、發(fā)酵液的制備； 4)血紅素的獲得。2.如權(quán)利要求1所述的一種從血粉中提取血紅素的方法，其特征在于:所述步驟I)枯草芽孢桿菌的制備中枯草芽孢桿菌的終密度為1.0X 109~5.0X 101° CFU/mL。3.如權(quán)利要求1所述的一種從血粉種提取血紅素的方法，其特征在于:步驟2)血粉水溶液制備為將曬干血粉與蒸餾水以1:15~1:30的比例混合，在高壓均質(zhì)設(shè)備中均質(zhì)0.5~lh，得到血粉水溶液。4.如權(quán)利要求1所述的一種從血粉種提取血紅素的方法，其特征在于:所述步驟3)接種、發(fā)酵液的制備為將步驟(2 )得到的血粉水溶液調(diào)節(jié)pH至6~9，按1°/『6%體積將步驟(I)中得到的枯草芽孢桿菌接種到步驟(2)所得的血粉水溶液，50~200rpm的轉(zhuǎn)速在25~40°C發(fā)酵6~48h，得到發(fā)酵液。5.如權(quán)利要求1所述的一種從血粉種提取血紅素的方法，其特征在于:所述步驟4)血紅素的獲得為離心步驟(3)得到的發(fā)酵液，3000~4000r/min，10~20min，收集上層溶液，調(diào)節(jié)pH值為3~5，使血紅素沉淀，3000~4000r/min,離心10~20min，收集沉淀，用蒸餾水和無水乙醇洗滌沉淀，烘干，即得血紅素成品。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種從血粉中提取血紅素的方法,包括以下步驟：1）枯草芽孢桿菌的制備；2）血粉水溶液制備；3）接種、發(fā)酵液的制備；4）血紅素的獲得。本發(fā)明所述方法，提高了血紅素的提取率，利用環(huán)保無污染的方法從血粉中提取血紅素，反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)品無毒副作用，不僅避免了污染環(huán)境、試劑毒性大和回收困難等問題，同時(shí)節(jié)約生產(chǎn)成本，提高了產(chǎn)品的安全性，并增加了對(duì)血資源的利用，解決了新鮮血液作為原料的不便之處。
【IPC分類】C12R1/125, C12P17/18
【公開號(hào)】CN104928328
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510208419
【發(fā)明人】劉平祥, 鄭艷艷
【申請(qǐng)人】廣州驅(qū)動(dòng)力飼料有限公司
【公開日】2015年9月23日
【申請(qǐng)日】2015年6月26日