等鞭金藻的培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于海洋生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及海洋單細(xì)胞微藻等鞭金藻的培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 湛江等鞭金藻（Isochrysis zhangjiangensis)，系金藻門，定鞭金藻綱，等鞭藻 目，等鞭藻科，等鞭藻屬。作為一種常見的單細(xì)胞海洋微藻，其生長(zhǎng)速率快、光合利用效率 高，富含蛋白質(zhì)、多糖、油脂、多不飽和脂肪酸等營(yíng)養(yǎng)成分，是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的微藻。其 細(xì)胞內(nèi)活性蛋白和活性多糖在生物醫(yī)藥、食品保健等方面有很好的應(yīng)用價(jià)值。
[0003] 此外，海洋微藻中的高油脂含量也使其成為生產(chǎn)新型生物柴油的潛在原料之一， 利用海洋微藻生產(chǎn)生物柴油，不僅可克服石油資源不可再生的缺點(diǎn)，而且能夠減少CO2的排 放，凈化廢氣和污水。在培養(yǎng)微藻制取生物柴油的過程中，通過添加營(yíng)養(yǎng)及優(yōu)化培養(yǎng)條件獲 得目標(biāo)產(chǎn)物--生物柴油的同時(shí)，可獲得藻細(xì)胞中的其他高附加值的代謝產(chǎn)物。
[0004] 另一方面尚需解決的問題是，在利用微藻細(xì)胞內(nèi)的油脂生產(chǎn)生物柴油的過程中， 會(huì)產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物甘油，對(duì)生物柴油副產(chǎn)物甘油的利用研宄有助于避免資源浪費(fèi)，降低 微藻培養(yǎng)及生物柴油生產(chǎn)的成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種等鞭金藻的培養(yǎng)方法，所述方法包括向培養(yǎng)體系中添 加濃度為412~1372mmol/L的甘油的步驟。
[0006] 使用本發(fā)明的上述方法進(jìn)行等鞭金藻培養(yǎng)，具有以下顯著特點(diǎn)：
[0007] ①蛋白質(zhì)含量明顯高：本發(fā)明所得到的藻細(xì)胞蛋白質(zhì)含量顯著提高，藻細(xì)胞蛋白 質(zhì)的含量和產(chǎn)量最高分別達(dá)到細(xì)胞干重的32 %和0. 56g干重/L，分別比對(duì)照組提高60 %和 86%，為利用等鞭金藻生產(chǎn)高價(jià)值蛋白質(zhì)提供了一種新的培養(yǎng)方法。
[0008] ②培養(yǎng)體系中甘油濃度較高，以甘油作為有機(jī)碳源培養(yǎng)等鞭金藻，在明顯提高藻 細(xì)胞蛋白質(zhì)含量的同時(shí)，也為生物柴油副產(chǎn)物甘油的實(shí)際利用提供了一種新途徑。
[0009] ③利用生物柴油副產(chǎn)物甘油培養(yǎng)等鞭金藻不僅能提高細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的含量和產(chǎn) 量，還能提高細(xì)胞內(nèi)的油脂和脂肪酸含量，從而降低等鞭金藻的培養(yǎng)成本和生物柴油的生 產(chǎn)成本，提高等鞭金藻的整體利用價(jià)值。
【附圖說明】
[0010] 本發(fā)明附圖2幅：
[0011] 圖1是等鞭金藻生長(zhǎng)曲線；
[0012] 圖2是蛋白質(zhì)溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0013] 無特殊說明，本發(fā)明所述的等鞭金藻藻種是從大連附近海域分離篩選出的野生型 湛江等鞭金藻（Isochrysis zhangjiangensis)，現(xiàn)保藏于中國科學(xué)院淡水藻種庫，藻種編 號(hào)為FACHB-1750。藻液來自該等鞭金藻的培養(yǎng)液。
[0014] 本發(fā)明中，采用考馬斯亮藍(lán)比色法（Analytical Biochemist ry, 1976, 72(1-2) :248-254. Hydrobiologia, 1981，78(3) :237-251.)測(cè)定蛋白質(zhì)含量，并計(jì) 算其產(chǎn)量。
[0015] 本發(fā)明所述的等鞭金藻的培養(yǎng)方法主要特征在于包括向培養(yǎng)體系中添加濃度為 412~1372mmol/L的甘油的步驟。其中，所添加的甘油濃度優(yōu)選686~1372mmol/L，尤其 優(yōu)選 686mmol/L。
【具體實(shí)施方式】 [0016] 之一，上述本發(fā)明的方法中，所述的甘油于培養(yǎng)第3±1天添加至培 養(yǎng)體系。
[0017] 另一【具體實(shí)施方式】中，所述的方法使用的培養(yǎng)基為3XF/2培養(yǎng)基，通過如下方法 制備：
[0018] (1)母液制備：
[0019] 氮源母液：稱取75g NaNO3溶于IL去離子水；
[0020] 磷源母液：稱取5g NaH2PO4 · H2O溶于IL去離子水；
[0021] 金屬元素母液：分別稱取 3. 15g FeCl3 · 6H20, 4. 36g Na2EDTA, 0· 0098g CuSO4 · 5H20, 0. 0063g Na2MoO4 · 2H20, 0. 022g ZnSO4 · 7H20, 0.0 lg CoCl2 · 6H20, 0. 18g MnCl2 · 4H20溶于IL去離子水；
[0022] 維生素母液：0· OOlg vitamin B12,0· 2g vitamin B1,0· OOlg D-生物素，溶于 IL去 離子水；
[0023] (2)配制3XF/2培養(yǎng)基：基礎(chǔ)海水中添加上述氮源母液3ml/L、磷源母液3ml/L、 金屬元素母液3ml/L及維生素母液I. 5ml/L，均勾混合。
[0024] 其中，所述的基礎(chǔ)海水優(yōu)選天然海水經(jīng)臭氧殺菌，兩層0. 45 μ m醋酸纖維濾膜過 濾，ll〇°C滅菌15min，冷卻后所得。
[0025] 再一具體的實(shí)施方式中，所述等鞭金藻的培養(yǎng)方法中，優(yōu)選在指數(shù)生長(zhǎng)期，每24 小時(shí)向培養(yǎng)體系中添加75mg/L硝酸鈉。
[0026] 更為具體的實(shí)施方式中，所述等鞭金藻的培養(yǎng)方法中，培養(yǎng)條件包括：培養(yǎng)溫度 23~27°C，光強(qiáng)110~150ymol/m 2 · s，光暗比為14h :10h，以通氣速率0· 1~0· 3vvm通 入含4.0% 0)2的空氣。
[0027] 最為具體地，本發(fā)明所述的等鞭金藻的培養(yǎng)方法是將指數(shù)生長(zhǎng)期的等鞭金藻按 3X 106cellS/mL的密度接種于滅菌的3XF/2培養(yǎng)基；培養(yǎng)至第3±1天，向培養(yǎng)體系中加入 濃度為686~1372mmol/L的甘油；并于指數(shù)生長(zhǎng)期，每24小時(shí)向培養(yǎng)體系中添加75mg/L 硝酸鈉；全培養(yǎng)過程設(shè)置培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度23~27°C，光強(qiáng)110~150 μmol/m2 *s，光 暗比為14h :10h，以通氣速率0. 1~0. 3vvm通入含4. 0% 0)2的空氣；培養(yǎng)至平衡期收獲藻 細(xì)胞；
[0028] 其中，3 X F/2培養(yǎng)基通過如下方法制備：
[0029] a.母液制備：
[0030] 氮源母液：稱取75g NaNO3溶于IL去離子水；
[0031] 磷源母液：稱取5g NaH2PO4 · H2O溶于IL去離子水；
[0032] 金屬元素母液：分別稱取 3. 15g FeCl3 · 6H20, 4. 36g Na2EDTA, 0· 0098g CuSO4 · 5H20, 0. 0063g Na2MoO4 · 2H20, 0. 022g ZnSO4 · 7H20, 0.0 lg CoCl2 · 6H20, 0. 18g MnCl2 · 4H20溶于IL去離子水；
[0033] 維生素母液：0· OOlg vitamin Β12,0· 2g vitamin B1,0· OOlg D-生物素，溶于 IL去 離子水；
[0034] b.配制3XF/2培養(yǎng)基：天然海水經(jīng)臭氧殺菌，兩層0.45μπι醋酸纖維濾膜過濾， 110°C滅菌15min，冷卻后得基礎(chǔ)海水，向其中添加上述氮源母液3ml/L、磷源母液3ml/L、金 屬元素母液3ml/L及維生素母液I. 5ml/L，均勻混合制得3XF/2培養(yǎng)基。
[0035] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明，這些實(shí)施例不應(yīng)當(dāng)被理解為對(duì)本

【發(fā)明內(nèi)容】
任何形式的限制。
[0036] 實(shí)施例1 :培養(yǎng)過程生長(zhǎng)周期的確定
[0037] 每天用 Jasco V-530 UV/VIS Spectrophotometer (JASCO, Tokyo, Japan)測(cè)定等鞭 金藻的細(xì)胞密度。在680nm處測(cè)定培養(yǎng)液中的等鞭金藻細(xì)胞的光密度，利用公式"細(xì)胞密 度（X10 7Cells/mL) = (0D68QX 1250 - 90. 125) X稀釋倍數(shù)"計(jì)算出對(duì)應(yīng)的細(xì)胞密度。繪 制生長(zhǎng)曲線，以判定細(xì)胞生長(zhǎng)的生長(zhǎng)周期。不同甘油濃度時(shí)，等鞭金藻細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線見圖 1。 由圖可見，等鞭金藻培養(yǎng)至2天時(shí)進(jìn)入快速的指數(shù)生長(zhǎng)期，培養(yǎng)至7天時(shí)進(jìn)入平衡期。
[0038] 實(shí)施例2 :營(yíng)養(yǎng)鹽及培養(yǎng)基配制
[0039] F/2營(yíng)養(yǎng)鹽母液配制：
[0040] I ·氮源母液：稱取75g NaNO3溶于IL去離子水；
[0041] II .磷源母液：稱取5g NaH2PO4 · H2O溶于IL去離子水；
[0042] III ·金屬元素母液：分別稱取 3. 15g FeCl3 · 6H20, 4. 36g Na2EDTA, 0· 0098g CuSO4 · 5H20, 0. 0063g Na2MoO4 · 2H20, 0. 022g ZnSO4 · 7H20, 0.0 lg CoCl2 · 6H20, 0. 18g MnCl2 · 4H20溶于IL去離子水；
[0043] IV ·維生素母液：0· OOlg vitamin B12,0· 2g vitamin B1,0· OOlg D-生物素，