一種耐阿霉素u87細胞模型及其應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及細胞模型的建立，具體地說，涉及一種耐阿霉素 U87細胞模型及其應 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 腦膠質(zhì)瘤是由于大腦和脊髓膠質(zhì)細胞癌變所產(chǎn)生的、最常見的原發(fā)性顱腦腫瘤。 年發(fā)病率約為3-8人/10萬人口。如同其他腫瘤（疾?。┮粯?，膠質(zhì)瘤也是由于先天的遺 傳高危因素和環(huán)境的致癌因素相互作用所導致的。一些已知的遺傳疾病，例如神經(jīng)纖維瘤 ?。↖型）以及結(jié)核性硬化疾病等，為腦膠質(zhì)瘤的遺傳易感因素。
[0003] 化療藥物阿霉素（DOX)通過細胞內(nèi)途徑促進腫瘤細胞凋亡，常用于腦膠質(zhì)瘤的治 療，但易發(fā)生耐藥，而耐藥后再化療效果很差。普通腦膠質(zhì)瘤細胞株在研宄腦膠質(zhì)瘤耐藥機 制中存在局限性，而腦膠質(zhì)瘤耐藥細胞株更能從分子生物學角度來研宄其耐藥機制，有助 于進一步尋找腦膠質(zhì)瘤耐藥后的治療方法。同時，腦膠質(zhì)瘤等腫瘤也可導致癲癇發(fā)作，導致 難治性癲癇，腦膠質(zhì)瘤耐藥細胞株也可用于難治性癲癇耐藥的研宄。
[0004] 中國期刊《中華神經(jīng)外科雜志》2009年4月第25卷第4期，刊出的論文"人神經(jīng) 膠質(zhì)瘤耐阿霉素細胞株的建立及其耐藥機制的初步研宄"，選用常用的化療藥物阿霉素和 人惡性膠質(zhì)母細胞瘤細胞株SHG44為研宄對象，用ADM濃度梯度遞增結(jié)合間歇誘導法建立 多藥耐藥的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞株SHG44/ADM，并對SHG44/ADM的耐藥特性及機制進行了初步 研宄，其建立的人神經(jīng)膠質(zhì)瘤耐藥細胞株SHG44/ADM通過藥敏實驗表明對ADM的IC50為 17. 83±0. 52,耐藥指數(shù)為10. 7,凍存3個月、復蘇后對ADM耐藥指數(shù)為10. 5,對耐藥的穩(wěn)定 性無明顯影響。
[0005] 中國期刊《中國臨床神經(jīng)外科雜志》2014年02期，刊出的論文"膠質(zhì)瘤多藥耐藥 細胞株U251/TMZ的生物學特性"，探討了膠質(zhì)瘤U25/替莫唑胺（TMZ)多藥耐藥細胞株的生 物學特性，采用TMZ間歇濃度梯度遞增法誘導建立膠質(zhì)瘤多藥耐藥細胞株U251/TMZ，光鏡 觀察細胞形態(tài)，細胞計數(shù)計算倍增時間，四甲基偶氮唑藍法檢測耐藥指數(shù)，流式細胞儀檢測 細胞周期，逆轉(zhuǎn)錄-PCR法檢測多藥耐藥性I(MDRl)、Bcl-2、多藥耐藥相關(guān)蛋白5 (MRP5)、肺 耐藥相關(guān)蛋白I(LRPl)等mRNA表達，結(jié)果膠質(zhì)瘤耐藥細胞株U251/TMZ對TMZ、依托泊苷、 硫酸長春新堿、環(huán)磷酰胺、阿霉素的耐藥指數(shù)分別為4. 39、3. 61、2. 64、2. 00、1. 63。
[0006] U87細胞是人腦膠質(zhì)瘤細胞系，被用于人腦膠質(zhì)瘤病理機制的研宄，以及人腦膠質(zhì) 瘤藥物的篩選等。目前還未見耐阿霉素 U87細胞模型的相關(guān)報道。而建立更多的耐藥細胞 模型對于探討人腦膠質(zhì)瘤耐藥產(chǎn)生原因及其機制，進一步指導對人腦膠質(zhì)瘤的治療具有重 要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種耐阿霉素 U87細胞模型。
[0008] 本發(fā)明的再一的目的是，提供所述的耐阿霉素 U87細胞模型的用途。
[0009] 本發(fā)明的第三個目的是，提供所述的耐阿霉素 U87細胞模型的建立方法。
[0010] 為實現(xiàn)上述第一個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0011] -種耐阿霉素 U87細胞模型，所述的耐阿霉素 U87細胞模型的保藏號為CCTCC C201531。
[0012] 為實現(xiàn)上述第二個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0013] 所述的耐阿霉素 U87細胞模型的用途，用于研宄腦膠質(zhì)瘤耐藥機制、尋找腦膠質(zhì) 瘤耐藥逆轉(zhuǎn)的靶點、篩選治療腦膠質(zhì)瘤或解除腦膠質(zhì)瘤耐藥的藥物。
[0014] 所述的耐阿霉素 U87細胞模型的用途，用于腦膠質(zhì)瘤引起的難治性癲癇的機制研 宄、尋找腦膠質(zhì)瘤引起的癲癇的耐藥逆轉(zhuǎn)靶點、篩選治療腦膠質(zhì)瘤引起的癲癇或解除腦膠 質(zhì)瘤引起的癲癇耐藥的藥物。
[0015] 為實現(xiàn)上述第三個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0016] 所述的耐阿霉素 U87細胞模型的建立方法，它包括以下步驟：
[0017] a)培養(yǎng)U87細胞；
[0018] b)U87細胞用阿霉素開始干預，然后換無阿霉素培養(yǎng)基，至細胞生長恢復正常即細 胞穩(wěn)定生長、形態(tài)飽滿、無漂浮死細胞、傳代密度為30%的情況下3至5天可長至90%后再 開始正常傳代并提高阿霉素的濃度，每次阿霉素的干預時間均為24小時；
[0019] c)對干預后的U87細胞進行檢測，獲得耐阿霉素 U87細胞模型。
[0020] 本發(fā)明優(yōu)點在于：
[0021] 本發(fā)明通過科學的方法建立了耐阿霉素 U87細胞模型，建立細胞模型的過程不 是機械式設置藥物濃度梯度和定期傳代，最后篩選出存活的細胞系，而是密切觀測細胞生 長狀態(tài)，待達到細胞形態(tài)飽滿，無漂浮死細胞，細胞密度為30 %的情況下3至5天可長至 90%后再開始正常傳代并提高阿霉素的濃度，通過該方法建立了一株耐阿霉素 U87細胞模 型，其耐藥系數(shù)均顯著高于現(xiàn)有的腦膠質(zhì)瘤細胞模型，且耐藥穩(wěn)定性好，且耐藥性和耐藥穩(wěn) 定性均優(yōu)于相同方法得到的其他耐阿霉素 U87細胞株。本發(fā)明建立的細胞模型可用于腦膠 質(zhì)瘤耐藥機制、腦膠質(zhì)瘤耐藥逆轉(zhuǎn)、預防腦膠質(zhì)瘤化療耐藥和提高腦膠質(zhì)瘤化療敏感性方 面的研宄，還可用于腦膠質(zhì)瘤引起的難治性癲癇的機制研宄、尋找癲癇耐藥逆轉(zhuǎn)的靶點、篩 選治療癲癇或解除癲癇耐藥的藥物。
【具體實施方式】
[0022] 下面對本發(fā)明提供的【具體實施方式】作詳細說明。
[0023] 實施例1
[0024] 一、實驗材料
[0025] U87細胞購自中科院。
[0026] 阿霉素（DOX)購自凱基生物（中國，南京）。
[0027] 阿霉素工作液用細胞培養(yǎng)基（SH30243. 01B+10% FBS，購自美國HyClone公司）配 制。
[0028] 二、實驗方法
[0029] 1)U87 細胞用 SH30243. 01B+10% FBS+100U/ml 青霉素 +0· lmg/ml 鏈霉素培養(yǎng)。 [0030] 2)用DOX起始濃度為lng/ml開始干預，給予DOX 24小時后換無藥培養(yǎng)基 (SH30243. 01B+10% FBS+lOOU/ml 青霉素 +0· lmg/ml 鏈霉素）。
[0031] 3)待細胞穩(wěn)定生長、形態(tài)飽滿、無漂浮死細胞、傳代密度為30%的情況下3至5天 可長至90 %后再開始正常傳代（P)并提高DOX的濃度。
[0032] 母細胞U87在第5代起（P5)到PlO加 lng/ml DOX干預，共3次，每次24小時；在 P6,加 5ng/ml DOX 干預 2 次；在 P7-P9,加 10ng/ml DOX 干預，共 3 次；在 P10-P11，加 30ng/ ml DOX 干預，共 2 次；在 P12-P14,加 50ng/ml DOX 干預，共 6 次；在 P15-P17,加 100ng/ml DOX干預，共7次；在P18-P22,加150ng/ml DOX干預，共8次。細胞生長良好，-80°C儲存。
[0033] 細胞每次干預24小時后更換無 DOX培養(yǎng)基，至細胞生長恢復正常（即細胞穩(wěn)定生 長、形態(tài)飽滿、無漂浮死細胞）后再進入下一輪DOX干預。歷時5個月，最終在U87細胞株 中DOX至150ng/ml，標記為人星形膠質(zhì)瘤細胞株U87R-D0X。耐藥株建立過程中U87共傳 19代。該耐藥株已于2015年4月1日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（中國武漢大學， 430072)，保藏編號為CCTCC C201531，培養(yǎng)物名稱為人星形膠質(zhì)瘤細胞株U87R-D0X。
[0034] 4)計算半抑制濃度（IC50)和耐藥系數(shù)（RI)。
[0035] 采用WST-I法（美國Roche公司）檢測細胞存活率。每孔5000個U87及人星形 膠質(zhì)瘤細胞株U87R-D0X細胞分別接種至96孔培養(yǎng)板，24小時后給予不同濃度的DOX (0， 0· 1，1，10,100, 500,1000ng/ml)干預，48小時后每孔加10 μ L WST-I試劑，在培養(yǎng)箱中37°C 繼續(xù)培養(yǎng)2小時，然后用酶標儀檢測450nm波長的吸光度。通過Graphpad Prism軟件計算 IC50。耐藥系數(shù)（RI)=耐藥株IC50/敏感株IC50。耐藥細胞建成后放-80°C冰柜凍存，1 個月、6個月后復蘇，再次檢測耐藥系數(shù)以確定其耐藥系數(shù)的穩(wěn)定性。
[0036] 三、實驗結(jié)果
[0037] 阿霉素對各U87細胞株的IC50見表1，人星形膠質(zhì)瘤細胞株U87R-D0X的耐藥系數(shù) 見表2。
[0038] 表1阿霉素對U87細胞株的IC50
[0042] 本發(fā)明為進一步研宄腦膠質(zhì)瘤的耐藥機制、逆轉(zhuǎn)腦膠質(zhì)瘤耐藥建立了可靠模型， 建立的耐藥細胞株的耐藥系數(shù)高，且耐藥細胞株的耐藥穩(wěn)定性很好。
[0043] 實施例2
[0044] 發(fā)明人在人星形膠質(zhì)瘤細胞株U87R-D0X建立過程中，平行實驗得到另一耐阿霉 素 U87細胞模型U87R-D0X'，其IC50為685ng/ml，耐藥系數(shù)（48小時）為20. 15,耐藥系數(shù) (1個月）為14. 32,耐藥系數(shù)（6個月）為12. 80。耐藥性和耐藥穩(wěn)定性均顯著差于人星形 膠質(zhì)瘤細胞株U87R-D0X。
[0045] 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進和補充，這些改進和補充也應視為 本發(fā)明的保護范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種耐阿霉素U87細胞模型，其特征在于，所述的耐阿霉素U87細胞模型的保藏號為 CCTCC C201531。2. 權(quán)利要求1所述的耐阿霉素U87細胞模型的用途，其特征在于，用于研宄腦膠質(zhì)瘤耐 藥機制、尋找腦膠質(zhì)瘤耐藥逆轉(zhuǎn)的靶點、篩選治療腦膠質(zhì)瘤或解除腦膠質(zhì)瘤耐藥的藥物。3. 權(quán)利要求1所述的耐阿霉素U87細胞模型的用途，其特征在于，用于腦膠質(zhì)瘤引起的 難治性癲癇的機制研宄、尋找腦膠質(zhì)瘤引起的癲癇的耐藥逆轉(zhuǎn)靶點、篩選治療腦膠質(zhì)瘤引 起的癲癇或解除腦膠質(zhì)瘤引起的癲癇耐藥的藥物。4. 權(quán)利要求1所述的耐阿霉素U87細胞模型的建立方法，其特征在于，它包括以下步 驟： a) 培養(yǎng)U87細胞； b) U87細胞用阿霉素開始干預，然后換無阿霉素培養(yǎng)基，至細胞生長恢復正常即細胞穩(wěn) 定生長、形態(tài)飽滿、無漂浮死細胞、傳代密度為30%的情況下3至5天可長至90%后再開始 正常傳代并提高阿霉素的濃度，每次阿霉素的干預時間均為24小時； c) 對干預后的U87細胞進行檢測，獲得耐阿霉素U87細胞模型。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種耐阿霉素U87細胞模型及其應用。本發(fā)明用阿霉素干預U87細胞，然后換無阿霉素培養(yǎng)基，至細胞穩(wěn)定生長、形態(tài)飽滿、無漂浮死細胞、傳代密度為30％的情況下3至5天可長至90％后再開始正常傳代并提高阿霉素的濃度，每次阿霉素的干預時間均為24小時，最后對干預后的U87細胞進行檢測，獲得耐阿霉素U87細胞模型，其保藏號為CCTCC NO：C201531。該細胞模型耐藥性強，耐藥系數(shù)高，且耐藥穩(wěn)定性很好，可用于研究腦膠質(zhì)瘤耐藥機制、尋找腦膠質(zhì)瘤耐藥逆轉(zhuǎn)的靶點、篩選治療腦膠質(zhì)瘤或解除腦膠質(zhì)瘤耐藥的藥物，也可用于腫瘤引起難治性癲癇的機制研究、尋找癲癇耐藥逆轉(zhuǎn)的靶點、篩選治療癲癇或解除癲癇耐藥的藥物。CCTCC NO：C20153120150401
【IPC分類】C12Q1/02, C12N5/09
【公開號】CN104946593
【申請?zhí)枴緾N201510215901
【發(fā)明人】邵一葉, 陳英輝
【申請人】復旦大學附屬金山醫(yī)院
【公開日】2015年9月30日
【申請日】2015年4月30日