一種分離并計(jì)數(shù)珊瑚體內(nèi)共生細(xì)菌的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及珊瑚體內(nèi)共生細(xì)菌的分離，尤其是涉及一種分離并計(jì)數(shù)珊瑚體內(nèi)共生細(xì)菌的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]珊瑚是近岸海域生物多樣性的源泉，珊瑚生態(tài)系統(tǒng)的健康和完整是近岸生態(tài)系統(tǒng)的一個(gè)重要屏障。珊瑚體內(nèi)的共生細(xì)菌對(duì)珊瑚的健康狀態(tài)具有舉足輕重的作用，分離珊瑚體內(nèi)共生細(xì)菌是了解珊瑚礁體內(nèi)共生細(xì)菌的豐度和群落組成的必須步驟。
[0003]現(xiàn)有技術(shù)存在以下不足:
[0004]文獻(xiàn)中對(duì)珊瑚體內(nèi)共生細(xì)菌的分析過程多采用分子生物學(xué)手段將珊瑚組織整體(含珊瑚蟲、共生藻類和細(xì)菌)進(jìn)行基因組的提取后對(duì)其中的細(xì)菌DNA序列進(jìn)行比對(duì)分析，由于對(duì)珊瑚組織整體基因組的提取過程的選擇性導(dǎo)致不能將所有細(xì)菌尤其是數(shù)量較少的細(xì)菌的DNA提取出來，同時(shí)根據(jù)DNA序列的比對(duì)分析技術(shù)難以在種的水平上鑒別共生細(xì)菌，因此基于DNA序列的分析方法只能作為珊瑚共生細(xì)菌鑒定的參考手段。對(duì)珊瑚礁中的共生細(xì)菌的分離和培養(yǎng)是鑒定和深入研宄珊瑚共生細(xì)菌的有效手段，而目前仍然缺乏有效可行的分離珊瑚共生細(xì)菌的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種分離并計(jì)數(shù)珊瑚體內(nèi)共生細(xì)菌的方法。
[0006]本發(fā)明包括以下步驟:
[0007]I)珊瑚樣品預(yù)處理；
[0008]2)制備珊瑚樣品勻漿液，過濾后得濾液；
[0009]3)在濾液中加入Teepol試劑，混勻，以無菌2216培養(yǎng)液稀釋后，涂布于2216固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，在2216固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落即為珊瑚共生細(xì)菌。
[0010]4)細(xì)菌的計(jì)數(shù)。
[0011]在步驟I)中，所述珊瑚樣品預(yù)處理的方法是以無菌蒸餾水沖洗珊瑚樣品的表面，將表面的雜物清洗干凈，放置在干凈的培養(yǎng)皿上晾干。
[0012]在步驟2)中，所述制備珊瑚樣品勻漿液的具體方法可為:將預(yù)處理后的珊瑚樣品放入無菌離心管中，加入2216培養(yǎng)液和陶瓷珠，蓋好離心管蓋，放置在振蕩儀中，對(duì)離心管中的混合物進(jìn)行振蕩均質(zhì)處理，得珊瑚樣品勻漿液；所述預(yù)處理后的珊瑚樣品與2216培養(yǎng)液的配比可為(0.2?0.5) g: lmL，其中，預(yù)處理后的珊瑚樣品以質(zhì)量計(jì)算，2216培養(yǎng)液以體積計(jì)算；所述陶瓷珠的用量可為20?30顆；所述振蕩均質(zhì)處理的條件可為2600rpm下振蕩60?80s ；
[0013]所述過濾的方法可為:將勻漿液倒入裝配3.0 μπι無菌濾膜的預(yù)滅菌的過濾器，連接過濾器到真空泵，過濾分離珊瑚骨架；所述無菌濾膜的直徑可為25_ ;所述過濾器可采用15mL玻璃濾杯；所述真空泵的真空度可< 5MPa。
[0014]在步驟3)中，所述Teepol試劑的加入量可為在每毫升濾液中加入10 μ L Teepol試劑；所述稀釋的方法可采用梯度稀釋法，將細(xì)胞液體分別按原液，10倍和100倍稀釋后各取100 μ L涂布于2216固體培養(yǎng)基上，每個(gè)稀釋度3個(gè)平行培養(yǎng)皿；所述培養(yǎng)可于恒溫培養(yǎng)箱25°C溫度下培養(yǎng)5?7天；若培養(yǎng)皿上的菌落之間分割不明顯或者長(zhǎng)成成片的細(xì)菌菌落，則說明該培養(yǎng)皿對(duì)細(xì)菌的分離失敗，重復(fù)步驟I)?3)，若步驟3)中的稀釋倍數(shù)需增加一個(gè)1000倍稀釋梯度，則對(duì)珊瑚共生細(xì)菌重新進(jìn)行分離。
[0015]在步驟4)中，所述細(xì)菌的計(jì)數(shù)的具體方法可將2216固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)出來的單一圓形的細(xì)菌菌落的數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，選擇菌落數(shù)在30?300個(gè)之間的培養(yǎng)皿，以該稀釋度3個(gè)平行培養(yǎng)皿的平均菌落數(shù)乘其稀釋倍數(shù)，即為該珊瑚樣品共生細(xì)菌數(shù)。
[0016]本發(fā)明對(duì)珊瑚中共生細(xì)菌的計(jì)數(shù)是將固體的珊瑚樣品以適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行勻漿，將勻漿液中的細(xì)菌在平板培養(yǎng)基上經(jīng)若干時(shí)間培養(yǎng)形成肉眼可見的菌落(一個(gè)菌落代表一個(gè)細(xì)胞)，通過計(jì)算平板上的菌落數(shù)而得知珊瑚樣品中共生細(xì)菌數(shù)。本發(fā)明的關(guān)鍵是盡可能將珊瑚樣品中的細(xì)菌勻漿分離出來同時(shí)在勻漿過程保持細(xì)菌的活力。
【具體實(shí)施方式】
[0017]以下實(shí)施例將對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0018]本發(fā)明實(shí)施例包括以下步驟:
[0019]①珊瑚樣品預(yù)處理
[0020]以無菌蒸餾水沖洗珊瑚樣品的表面，將表面的雜物清洗干凈，放置在干凈的培養(yǎng)皿上晾干。
[0021]②珊瑚樣品的勻漿
[0022]準(zhǔn)確稱取0.2?0.5g珊瑚樣品放入2mL無菌離心管中，加入ImL的無菌2216培養(yǎng)液和20?30顆陶瓷珠，蓋好離心管蓋，放置在振蕩儀(IKA，Vortex Genius 3)對(duì)離心管中的混合物進(jìn)行振蕩均質(zhì)處理(振蕩設(shè)置:2600rpm，振蕩時(shí)間60?80s)。
[0023]③勻漿液的過濾
[0024]將勾楽液倒入裝配了 3.Ομπι無菌濾膜(millipore，25mm直徑)的預(yù)滅菌的過濾器(millipore，15mL玻璃濾杯)，連接過濾器到真空泵(Millipore，真空度< 5MPa)，過濾分離珊瑚骨架。
[0025]④涂布分離
[0026]收集過濾下的濾液，每毫升溶液加入1yL Teepol試劑(Sigma-Aldrich)，混勾。根據(jù)濾液中的細(xì)菌數(shù)量多少，以無菌2216培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋濾液。一般采用梯度稀釋法，將細(xì)胞液體分別按原液，10倍和100倍稀釋后各取100 μ L涂布于2216固體培養(yǎng)基上，每個(gè)稀釋度3個(gè)平行培養(yǎng)皿，于恒溫培養(yǎng)箱(Binder，ΚΒ53) 25°C溫度下培養(yǎng)5?7天。5?7天培養(yǎng)完成后，2216固體平板上生長(zhǎng)的菌落即為珊瑚共生細(xì)菌。
[0027]注意:若培養(yǎng)皿上的菌落之間分割不明顯或者長(zhǎng)成成片的細(xì)菌菌落，則說明該培養(yǎng)皿對(duì)細(xì)菌的分離失敗，重復(fù)步驟①到④并視情況調(diào)整步驟④中的稀釋倍數(shù)如增加一個(gè)1000倍稀釋梯度，對(duì)珊瑚共生細(xì)菌重新進(jìn)行分離。
[0028]⑤細(xì)菌的計(jì)數(shù)
[0029]將2216固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)出來的單一的圓形的細(xì)菌菌落的數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，選擇菌落數(shù)在30?300個(gè)之間的培養(yǎng)皿，以該稀釋度3個(gè)平行培養(yǎng)皿的平均菌落數(shù)乘其稀釋倍數(shù)，即為該珊瑚樣品共生細(xì)菌數(shù)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種分離并計(jì)數(shù)珊瑚體內(nèi)共生細(xì)菌的方法，其特征在于包括以下步驟: 1)珊瑚樣品預(yù)處理； 2)制備珊瑚樣品勻漿液，過濾后得濾液； 3)在濾液中加入Teepol試劑，混勻，以無菌2216培養(yǎng)液稀釋后，涂布于2216固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，在2216固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落即為珊瑚共生細(xì)菌。 4)細(xì)菌的計(jì)數(shù)。2.如權(quán)利要求1所述一種分離并計(jì)數(shù)珊瑚體內(nèi)共生細(xì)菌的方法，其特征在于在步驟I)中，所述珊瑚樣品預(yù)處理的方法是以無菌蒸餾水沖洗珊瑚樣品的表面，將表面的雜物清洗干凈，放置在干凈的培養(yǎng)皿上晾干。3.如權(quán)利要求1所述一種分離并計(jì)數(shù)珊瑚體內(nèi)共生細(xì)菌的方法，其特征在于在步驟2)中，所述制備珊瑚樣品勻漿液的具體方法為:將預(yù)處理后的珊瑚樣品放入無菌離心管中，加入2216培養(yǎng)液和陶瓷珠，蓋好離心管蓋，放置在振蕩儀中，對(duì)離心管中的混合物進(jìn)行振蕩均質(zhì)處理，得珊瑚樣品勻漿液。4.如權(quán)利要求3所述一種分離并計(jì)數(shù)珊瑚體內(nèi)共生細(xì)菌的方法，其特征在于所述預(yù)處理后的珊瑚樣品與2216培養(yǎng)液的配比為(0.2?0.5) g: lmL，其中，預(yù)處理后的珊瑚樣品以質(zhì)量計(jì)算，2216培養(yǎng)液以體積計(jì)算。5.如權(quán)利要求3所述一種分離并計(jì)數(shù)珊瑚體內(nèi)共生細(xì)菌的方法，其特征在于所述陶瓷珠的用量為20?30顆。6.如權(quán)利要求3所述一種分離并計(jì)數(shù)珊瑚體內(nèi)共生細(xì)菌的方法，其特征在于所述振蕩均質(zhì)處理的條件為2600rpm下振蕩60?80s。7.如權(quán)利要求1所述一種分離并計(jì)數(shù)珊瑚體內(nèi)共生細(xì)菌的方法，其特征在于在步驟2)中，所述過濾的方法為:將勻漿液倒入裝配3.0 μπι無菌濾膜的預(yù)滅菌的過濾器，連接過濾器到真空泵，過濾分離珊瑚骨架；所述無菌濾膜的直徑可為25_ ;所述過濾器可采用15mL玻璃濾杯；所述真空泵的真空度可< 5MPa。8.如權(quán)利要求1所述一種分離并計(jì)數(shù)珊瑚體內(nèi)共生細(xì)菌的方法，其特征在于在步驟3)中，所述Teepol試劑的加入量為在每毫升濾液中加入10μ L Teepol試劑；所述稀釋的方法是采用梯度稀釋法，將細(xì)胞液體分別按原液，10倍和100倍稀釋后各取100 μ L涂布于2216固體培養(yǎng)基上，每個(gè)稀釋度3個(gè)平行培養(yǎng)皿；所述培養(yǎng)可于恒溫培養(yǎng)箱25°C溫度下培養(yǎng)5?7天。9.如權(quán)利要求1所述一種分離并計(jì)數(shù)珊瑚體內(nèi)共生細(xì)菌的方法，其特征在于在步驟3)中，若培養(yǎng)皿上的菌落之間分割不明顯或者長(zhǎng)成成片的細(xì)菌菌落，則說明該培養(yǎng)皿對(duì)細(xì)菌的分離失敗，重復(fù)步驟I)?3)，若步驟3)中的稀釋倍數(shù)需增加一個(gè)1000倍稀釋梯度，則對(duì)珊瑚共生細(xì)菌重新進(jìn)行分離。10.如權(quán)利要求1所述一種分離并計(jì)數(shù)珊瑚體內(nèi)共生細(xì)菌的方法，其特征在于在步驟4)中，所述細(xì)菌的計(jì)數(shù)的具體方法是將2216固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)出來的單一圓形的細(xì)菌菌落的數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，選擇菌落數(shù)在30?300個(gè)之間的培養(yǎng)皿，以該稀釋度3個(gè)平行培養(yǎng)皿的平均菌落數(shù)乘其稀釋倍數(shù)，即為該珊瑚樣品共生細(xì)菌數(shù)。
【專利摘要】一種分離并計(jì)數(shù)珊瑚體內(nèi)共生細(xì)菌的方法，涉及珊瑚體內(nèi)共生細(xì)菌的分離。珊瑚樣品預(yù)處理；制備珊瑚樣品勻漿液，過濾后得濾液；在濾液中加入Teepol試劑，混勻，以無菌2216培養(yǎng)液稀釋后，涂布于2216固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，在2216固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落即為珊瑚共生細(xì)菌。細(xì)菌的計(jì)數(shù)。將固體的珊瑚樣品以適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行勻漿，將勻漿液中的細(xì)菌在平板培養(yǎng)基上經(jīng)若干時(shí)間培養(yǎng)形成肉眼可見的菌落，通過計(jì)算平板上的菌落數(shù)而得知珊瑚樣品中共生細(xì)菌數(shù)。盡可能將珊瑚樣品中的細(xì)菌勻漿分離出來同時(shí)在勻漿過程保持細(xì)菌的活力。
【IPC分類】C12Q1/06
【公開號(hào)】CN104946725
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510407995
【發(fā)明人】歐丹云, 林榮澄, 陳彬
【申請(qǐng)人】國(guó)家海洋局第三海洋研究所
【公開日】2015年9月30日
【申請(qǐng)日】2015年7月13日