一種禾本科植物中通用的snp分型探針的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域和核酸檢測(cè)領(lǐng)域，具體設(shè)計(jì)一種用于禾本科植物SNP 分型的通用Taqman探針及其在禾本科植物SNP位點(diǎn)分型中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 禾本科植物是被子植物中最有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的一大類(lèi)，約有650多屬，10000余種，其 中我國(guó)約有200余屬，1200多種。禾本科植物是人類(lèi)糧食和牲畜飼料的主要來(lái)源，具有較高 的生態(tài)及觀賞價(jià)值，也是工業(yè)的重要原料。
[0003] 以小麥為例，小麥?zhǔn)俏覈?guó)第二大糧食作物，2013年我國(guó)小麥產(chǎn)量達(dá)到1.2193億 噸。小麥產(chǎn)量穩(wěn)定增長(zhǎng)和品質(zhì)不斷改良對(duì)保障國(guó)家糧食安全具有重要的意義。產(chǎn)量高、品 質(zhì)好和抗病性優(yōu)的小麥品種是小麥育種的終極目標(biāo)，分子標(biāo)記輔助選擇已成為小麥常規(guī)育 種的重要組成部分，SNP作為一種重要的分子標(biāo)記，在小麥遺傳育種中發(fā)揮著越來(lái)越重要的 作用。
[0004] 單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP)是指在基因組水平上 由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。與其它分子標(biāo)記比較，SNP具有位點(diǎn)多、分 布均勻等優(yōu)點(diǎn)使SNP作為分子標(biāo)記得以廣泛應(yīng)用。Taqman探針?lè)ㄊ荢NP檢測(cè)中常用的一種 方法，其檢測(cè)原理是應(yīng)用一對(duì)雙標(biāo)記Taqman探針，分別針對(duì)雙等位SNP的不同基因型，只有 完全匹配的探針才能擴(kuò)增出各自對(duì)應(yīng)的基因型；用兩種熒光染料Fam，Hex(Vic)分別標(biāo)記 這兩種探針，就可以在一次PCR反應(yīng)中完成對(duì)單個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型判定。Taqman探針?lè)?與其它SNP檢測(cè)方法相比較，具有靈活性大、精確度靈敏度高和操作簡(jiǎn)單快速等明顯的優(yōu) 點(diǎn)。
[0005] 但是目前依據(jù)Taqman探針?lè)ㄔ?，每鑒定一個(gè)SNP位點(diǎn)就需合成一對(duì)特異性 探針，對(duì)于待檢測(cè)SNP位點(diǎn)較多的情況下，整體用于合成探針的費(fèi)用很高，一般很難采用 Taqman探針?lè)ㄗ鯯NP分型。這個(gè)因素嚴(yán)重限制了 Taqman探針?lè)ㄔ赟NP檢測(cè)中的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對(duì)上述Taqman探針?lè)ù嬖诘膯?wèn)題，本發(fā)明旨在通過(guò)一種SNP分型通用Taqman 探針的設(shè)計(jì)，改進(jìn)現(xiàn)有Taqman探針?lè)?，降低?shí)驗(yàn)成本。
[0007] 對(duì)原有Taqman探針的改進(jìn)思路是：提出通過(guò)引物去識(shí)別SNP位點(diǎn)，而不是原 Taqman方法中的探針。PCR反應(yīng)體系中一共有三條引物：一條普通引物，兩條分型引物。分 型引物3'端最后一個(gè)核苷酸位點(diǎn)是要檢測(cè)的SNP位點(diǎn)，在其5'端加一段接頭核苷酸序列， 而探針的序列和分型引物的接頭序列相同。這樣不論檢測(cè)多少個(gè)SNP位點(diǎn)，只需設(shè)計(jì)一對(duì) 與分型引物接頭序列相同堿基的探針，探針與普通引物的擴(kuò)增子結(jié)合后，探針報(bào)告熒光集 團(tuán)與淬滅基團(tuán)分開(kāi)發(fā)出熒光，檢測(cè)進(jìn)而確定基因型信息，其原理如圖1所示。
[0008] 具體地，本發(fā)明涉及以下各項(xiàng)：
[0009] 本發(fā)明提供通用的SNP分型探針，其序列為SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4,其中，SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :3的5'端標(biāo)記有報(bào)告熒光基團(tuán)， SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :4的3'端標(biāo)記有淬滅熒光基團(tuán)。
[0010] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述報(bào)告熒光基團(tuán)選自FAM、HEX或VIC ;所述淬滅熒光基團(tuán) 選自 BHQl、TAMRA 或 Eclipse。
[0011] 本發(fā)明還提供所述SNP分型探針用于禾本科植物SNP檢測(cè)的用途。
[0012] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述禾本科植物選自小麥、水稻、玉米、青稞、燕麥、黑麥、高 粱、竹子。
[0013] 本發(fā)明還提供一種禾本科植物SNP的檢測(cè)方法，所述方法包括如下步驟：1)設(shè)計(jì) 3'端為待檢測(cè)SNP核苷酸的分型引物，所述分型引物在與模板互補(bǔ)序列的5'端包含接頭序 列，所述接頭序列與權(quán)利要求1所述探針的核苷酸序列相同；2)用所述分型引物和與模板 鏈非SNP區(qū)互補(bǔ)的普通引物擴(kuò)增；3)使用所述探針檢測(cè)，所述探針與步驟2)的擴(kuò)增子結(jié)合 后，探針的報(bào)告熒光集團(tuán)與淬滅熒光基團(tuán)分開(kāi)從而發(fā)出熒光，檢測(cè)進(jìn)而確定基因型信息。
[0014] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述探針和引物濃度比為1:2,所述引物包括所述分型引物 和所述普通引物。
[0015] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，標(biāo)記有報(bào)告熒光發(fā)光基團(tuán)探針與標(biāo)記有淬滅熒光基團(tuán)探針 濃度比為7:8。
[0016] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述普通引物與所述分型引物間濃度比為8:1。
[0017] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述禾本科植物選自小麥、水稻、玉米、青稞、燕麥、黑麥、高 粱、竹子。
[0018] 所述SNP分型探針為小麥中SNP分型相關(guān)的分子標(biāo)記，其可在小麥甚至禾本科植 物中通用檢測(cè)幾乎全部SNP位點(diǎn)。
[0019] PF:5'-CCAGCCTTCCTGAGTAGTGAT-3'（SEQ ID NO :1);
[0020] PBF:5,-ATCACTACTCAGGAAGGCTGG-3'（SEQ ID NO :2);
[0021] PV:5'-TAGATGAGTCGCAGCGTTAGA-3'（SEQ ID NO :3);
[0022] PBV:5'-TCTAACGCTGCGACTCATCTA-3'（SEQ ID NO :4)。
[0023] 序列表中SEQ ID NO :1命名為PF，由21個(gè)堿基組成，該序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行 了檢索，在小麥中未發(fā)現(xiàn)有同源區(qū)段，其5'端標(biāo)記有報(bào)告熒光基團(tuán)Fam。序列表中SEQ ID NO :2命名為PBF，由21個(gè)堿基組成，該序列與SEQ ID NO :1反向互補(bǔ)，其3'端標(biāo)記有淬滅 熒光基團(tuán)BHQ1。序列表中SEQ ID NO :3命名為PV，由21個(gè)堿基組成，該序列在NCBI數(shù)據(jù) 庫(kù)中進(jìn)行了檢索，在小麥中未發(fā)現(xiàn)有同源區(qū)段，其5'端標(biāo)記有報(bào)告熒光基團(tuán)Vic。序列表中 SEQ ID NO :4命名為PBV，由21個(gè)堿基組成，該序列與SEQ ID NO :3反向互補(bǔ)，其3'端標(biāo)記 有淬滅熒光基團(tuán)BHQl。本發(fā)明中發(fā)光和淬滅基團(tuán)分別在兩條反向互補(bǔ)的寡核苷酸序列上， 這種設(shè)計(jì)的特點(diǎn)是熒光淬滅效果好，熒光本底值比較低。雙鏈探針?lè)珠_(kāi)后即可檢測(cè)到熒光 信號(hào)，繼而進(jìn)行分型判定。
[0024] 與經(jīng)典Taqman探針?lè)磻?yīng)體系相比較，改進(jìn)后的反應(yīng)體系中包含有四條探針和三 條引物，反應(yīng)體系組分較多需要對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化主要針對(duì)探針和引物在反應(yīng)體系中的 濃度比，包括探針自身濃度比及普通引物與分型引物間濃度比。確定的最終反應(yīng)體系如表 1所示：
[0025] 表1 :PCR反應(yīng)體系
[0026]
[0027] PCR反應(yīng)條件可采用兩步法和touchdown法，touchdown法適用于擴(kuò)增效率不高的 情況，一般擴(kuò)增兩步法即可。兩步法擴(kuò)增條件為：94°C預(yù)變性3min ;94°C變性30sec，55°C 退火30sec，共40個(gè)循環(huán)。Touchdown法擴(kuò)增條件為：94°C預(yù)變性15min ;94°C變性20sec， 61°C退火60sec，以后每個(gè)循環(huán)依次降低0. 6°C，直到55°C，共10個(gè)循環(huán)；94°C變性20sec， 55°C退火26sec，共26個(gè)循環(huán)。
[0028] 本發(fā)明的有益效果為：通過(guò)對(duì)原Taqman探針?lè)ǖ母倪M(jìn)，降低了實(shí)驗(yàn)成本，使 Taqman探針?lè)鼙粡V泛應(yīng)用于小麥SNP分型檢測(cè)中。
【附圖說(shuō)明】
[0029] 圖1本發(fā)明的SNP檢測(cè)方法的原理圖
[0030] 圖2實(shí)施例中的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖
【具體實(shí)施方式】
[0031] 通過(guò)以下實(shí)施例并結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，但以下描述不對(duì)本發(fā) 明的保護(hù)范圍構(gòu)成任何意義上的限定。
[0032] 下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法。所用引物和探針由英濰捷基 (上海）貿(mào)易有限公司合成。
[0033] 1、選取具有兩種基因型的小麥GW2-6A基因序列區(qū)段，目標(biāo)位點(diǎn)上具有C/T兩種堿 基，分別見(jiàn)序列表SEQ ID N0:5(844bp)和SEQ ID N0:6(823bp)。將這個(gè)片段擴(kuò)增純化后 連接到T載體上，進(jìn)行轉(zhuǎn)化，搖菌提取質(zhì)粒，最終得到僅具有一個(gè)SNP位點(diǎn)差異的WS和0S5 質(zhì)粒，WS質(zhì)粒目標(biāo)位點(diǎn)上是C基因型，0S5質(zhì)粒是T基因型，將其作為分型對(duì)象。
[0034] 2、根據(jù)WS和0S5位點(diǎn)信息，分別設(shè)計(jì)兩條分型引物與一條普通引物：
[0035] 分型引物 I :CCAGCCTTCCTGAGTAGTGATCTTTTGAGCAACCAACGC(序列表中 SEQ ID NO : 7) ；
[0036] 分型引物 2 :TAGATGAGTCGCAGCGTTAGACTITTGAGCAACCAACGT (序列表中 SEQ ID NO : 8) ；
[0037] 普通引物：AGCCATAGCAGCAACAGC(序列表中 SEQ ID NO :9);
[0038] PCR 反應(yīng)體系為：質(zhì)粒模板 DNA 25ng，dNTP 0.25mmol/L，10Xbuffer，2.0yL，Taq DNA聚合酶0· 5U，分型引物1和2濃度0· 025 μ mol/L，普通引物濃度0· 2 μ mol/L，發(fā)光探針 (PB與PV)濃度0· 175 μ mol/L，淬滅探針（PBF和PBV)濃度0· 2 μ mol/L，總體積為20 μ L。 反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性3min ;94°C變性30sec，55°C退火30sec，共40個(gè)循環(huán)。
[0039] PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳分析：分別取擴(kuò)增產(chǎn)物3ul和1 μ I Loading buffer，將 混合物在I. 5%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分離，凝膠經(jīng)EB染色后用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察照 相。確定有IlObp目的條帶（見(jiàn)圖2)。
[0040] 3、檢測(cè)熒光強(qiáng)度：
[0041] 用固定激發(fā)波長(zhǎng)激發(fā)，固定發(fā)射波長(zhǎng)檢測(cè)：Fam :Ex = 492nm, Em = 520nm ;Vic:Ex =538nm, Em = 554nm。每個(gè)樣品重復(fù)掃三遍，取其平均值。依據(jù)兩處讀值來(lái)判定待測(cè)質(zhì)粒 的基因型，WS與0S5在492nm和520nm處熒光讀值見(jiàn)下表。
[0042] 表2 :PCR擴(kuò)增后熒光讀值
[0043]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 通用的 SNP 分型探針，其序列為 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3 和 SEQ ID NO :4,其中，SEQ ID NO :1 和 SEQ ID NO :3標(biāo)記有報(bào)告熒光基團(tuán)，SEQ ID NO :2 和 SEQ ID NO :4標(biāo)記有淬滅熒光基團(tuán)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的SNP分型探針，所述報(bào)告熒光基團(tuán)選自FAM、HEX或VIC ;所述 淬滅熒光基團(tuán)選自BHQ1、TAMRA或Eclipse。3. 權(quán)利要求1或2所述SNP分型探針用于禾本科植物SNP檢測(cè)的用途。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，所述禾本科植物選自小麥、水稻、玉米、青稞、燕麥、黑 麥、高粱、竹子。5. -種禾本科植物SNP的檢測(cè)方法，所述方法包括如下步驟： 1) 設(shè)計(jì)3'端為待檢測(cè)SNP核苷酸的分型引物，所述分型引物在與模板互補(bǔ)序列的5' 端包含接頭序列，所述接頭序列與權(quán)利要求1所述探針的核苷酸序列相同； 2) 用所述分型引物和與模板鏈非SNP區(qū)互補(bǔ)的普通引物進(jìn)行擴(kuò)增； 3) 使用權(quán)利要求1所述探針檢測(cè)，所述探針與步驟2)的擴(kuò)增子結(jié)合后，探針的報(bào)告熒 光集團(tuán)與淬滅熒光基團(tuán)分開(kāi)從而發(fā)出熒光，檢測(cè)進(jìn)而確定基因型信息。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述探針和引物濃度比為1:2,所述引物包括分型 引物和普通引物。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中標(biāo)記有報(bào)告熒光發(fā)光基團(tuán)探針與標(biāo)記有淬滅熒光 基團(tuán)探針濃度比為7:8。8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述普通引物與所述分型引物間濃度比為8:1。9. 根據(jù)權(quán)利要求6-8任一項(xiàng)所述的方法，所述禾本科植物選自小麥、水稻、玉米、青稞、 燕麥、黑麥、高粱、竹子。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種禾本科植物中通用的SNP分型探針，所述探針由兩對(duì)各自反向互補(bǔ)的寡核苷酸序列組成，報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分別位于反向互補(bǔ)的寡核苷酸鏈上。通過(guò)所述SNP分型通用Taqman探針的設(shè)計(jì)，改進(jìn)現(xiàn)有Taqman探針?lè)?，降低?shí)驗(yàn)成本，使Taqman探針SNP分型法能被廣泛應(yīng)用于禾本科植物SNP檢測(cè)中。
【IPC分類(lèi)】C12Q1/68, C12N15/11
【公開(kāi)號(hào)】CN104946748
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510290157
【發(fā)明人】劉瑞娟, 劉寶龍, 劉迪, 車(chē)國(guó)冬, 蔡振媛
【申請(qǐng)人】中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所
【公開(kāi)日】2015年9月30日
【申請(qǐng)日】2015年6月1日