斯氏艾美耳球蟲(chóng)體內(nèi)表達(dá)外源基因的一種rna轉(zhuǎn)染系統(tǒng)的制作方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】
[0001]技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明公開(kāi)了斯氏艾美耳球蟲(chóng)病毒的核酸序列，及一種以斯氏艾美耳球蟲(chóng)病毒RNA為載體的外源基因在斯氏艾美耳球蟲(chóng)體內(nèi)表達(dá)的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，屬于基因工程領(lǐng)域。
[0002]【背景技術(shù)】:
兔球蟲(chóng)病是由艾美耳屬球蟲(chóng)引起的一種寄生性原蟲(chóng)病。已經(jīng)報(bào)道的感染家兔的艾美耳屬球蟲(chóng)有17種，其中斯氏艾美耳球蟲(chóng)Es)的致病力最強(qiáng)、危害最大。它寄生于兔的肝膽管上皮細(xì)胞，能引起嚴(yán)重的肝球蟲(chóng)病，對(duì)養(yǎng)兔業(yè)的危害最大。長(zhǎng)期以來(lái)，兔球蟲(chóng)病主要依靠化學(xué)藥物進(jìn)行治療，由于球蟲(chóng)極易產(chǎn)生耐藥性，給藥物防治也帶來(lái)了困難。其主要原因就是缺乏一種研宄斯氏艾美耳球蟲(chóng)細(xì)胞和分子生物學(xué)特征的基因工程工具。早在1989年就已報(bào)道在斯氏艾美耳球蟲(chóng)體內(nèi)觀察到了病毒粒子的存在，但目前仍未見(jiàn)關(guān)于斯氏艾美耳球蟲(chóng)病毒核酸序列及以斯氏艾美耳球蟲(chóng)病毒RNA為載體的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)的報(bào)導(dǎo)。
[0003]
【發(fā)明內(nèi)容】
:
本發(fā)明所述的一種斯氏艾美耳球蟲(chóng)病毒的核酸序列，基因序列如SEQ n0.1所示，其全長(zhǎng)為6219bp，含有2個(gè)開(kāi)放閱讀框(open reading frames (ORF))，之間有四個(gè)堿基的重疊。其開(kāi)放閱讀框前39Ibp為5’非編碼區(qū)，第392bp到279Ibp為ORFl，編碼800個(gè)氨基酸的衣殼蛋白，理論相對(duì)分子量為86.471 kDa。第2788bp到6090bp為0RF2，編碼1101個(gè)氨基酸的RNA依賴(lài)RNA聚合酶蛋白，理論相對(duì)分子量為118.850 kDa。第6091bp到6219bp為3’非編碼區(qū)。
[0004]本發(fā)明所述的一種斯氏艾美耳球蟲(chóng)病毒轉(zhuǎn)染載體，該轉(zhuǎn)染系統(tǒng)含有多克隆酶切位點(diǎn)，方便外源基因轉(zhuǎn)入斯氏艾美耳球蟲(chóng)體內(nèi)，對(duì)其基因表達(dá)調(diào)控、基因功能及生化代謝等特征的研宄。
[0005]本發(fā)明所述的一種斯氏艾美耳球蟲(chóng)病毒轉(zhuǎn)染載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟:
1)通過(guò)PCR擴(kuò)增在5’非編碼區(qū)前端引入T7啟動(dòng)子，將含有外源基因和多克隆酶切位點(diǎn)的基因序列替換斯氏艾美球蟲(chóng)病毒基因組的部分編碼區(qū)；
2)應(yīng)用T7 RiboMAX (TM) Express Large Scale RNA Product1n System 進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄;
3)將體外轉(zhuǎn)錄的RNA電穿孔至斯氏艾美耳球蟲(chóng)未孢子化卵囊內(nèi)進(jìn)行外源基因的表達(dá)。
[0006]本發(fā)明的有益效果在于:
提供了斯氏艾美耳球蟲(chóng)病毒基因組dsRNA全長(zhǎng)cDNA序列6219bp。所構(gòu)建的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)含有多克隆酶切位點(diǎn)，方便外源基因在斯氏艾美耳球蟲(chóng)體內(nèi)的表達(dá)。該病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)的構(gòu)建，為研宄斯氏艾美耳球蟲(chóng)基因功能和生物學(xué)特性提供了有利的工具。
[0007]【附圖說(shuō)明】:
圖1A，圖1B，圖1C分別為含綠色熒光蛋白(EGFP)的EsRVl RNA轉(zhuǎn)染載體的構(gòu)建，含紅色熒光蛋白(RFP)的EsRVl RNA轉(zhuǎn)染載體的構(gòu)建，含綠色熒光蛋白(EGFP)及紅色熒光蛋白(RFP)的EsRVl RNA轉(zhuǎn)染載體的構(gòu)建；
圖2 A，圖2B，圖2C為本發(fā)明檢測(cè)綠色熒光蛋白及紅色熒光蛋白在球蟲(chóng)體內(nèi)的表達(dá)。
[0008]【具體實(shí)施方式】:
通過(guò)以下實(shí)施例進(jìn)一步舉例描述本發(fā)明，并不以任何方式限制本發(fā)明。下面用實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性?xún)?nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。
[0009]實(shí)施例1
含綠色熒光蛋白(EGFP)的斯氏艾美耳球蟲(chóng)病毒RNA轉(zhuǎn)染載體的構(gòu)建
如附圖1A所示，根據(jù)斯氏艾美耳球蟲(chóng)病毒(EsRVl)基因組dsRNA的序列特征，將綠色焚光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)基因替換 dsRNA 的第 452 位到5985位核酸序列，構(gòu)建EsRVl與EGFP的轉(zhuǎn)染載體。用PCR擴(kuò)增反應(yīng)將T7啟動(dòng)子引入到dsRNA cDNA的5’非編碼區(qū)的前端的同時(shí)，用PCR方法從EsRVl dsRNA cDNA擴(kuò)增EsRVl的5’ 端 451bp (包括 5’ UTRs)，3’端 234bp (包括 3’ UTRs)及從實(shí)驗(yàn)室保存的 pMD18-T_Green質(zhì)粒擴(kuò)增EGFP編碼區(qū)序列(717bp)。將三個(gè)片段分別克隆到pMD18-T載體上，得到重組質(zhì)粒pEsRV451-EGFP-pEsRV234。重組質(zhì)粒 pEsRV451_EGFP_pEsRV234 經(jīng) PCR 擴(kuò)增后，PCR 產(chǎn)物凝膠回收，定量后作為模板，用 T7 RiboMAX? Express Large Scale RNA Product1n System進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。每管20μ?反應(yīng)液包括:RiboMAX? Express T7 2XBuffer 10μ?，PCR純化產(chǎn)物 8μ?，Τ7 Enzyme Mix 2μ?。37°C 反應(yīng) 30min，加 IyL DNase 消化 DNA 模板，電泳觀察轉(zhuǎn)錄結(jié)果后，在BTX電轉(zhuǎn)杯中加入20μ? pEsRV451-EGFP-pEsRV234體外轉(zhuǎn)錄體RNA、5(^L未孢子化卵囊(I X 15個(gè))和30μ? Cytomix溶液，冰浴15min后進(jìn)行電轉(zhuǎn)化。電轉(zhuǎn)化條件為:電壓500V、脈沖時(shí)間0.3ms間隔10ms連續(xù)進(jìn)行三次電擊反應(yīng)。之后冰浴20min，將未孢子化卵囊轉(zhuǎn)移至24孔板中，加入適量的重鉻酸鉀，于28.5°C溫箱中進(jìn)行孢子化。提取pEsRV451-EGFP-pEsRV234株孢子化卵囊的dsRNA，以此為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增EGFP基因。同時(shí)提取孢子化后的蟲(chóng)體蛋白進(jìn)行Western blot分析。結(jié)果均可檢測(cè)到綠色熒光蛋白的表達(dá)(見(jiàn)附圖2A)。說(shuō)明可以利用斯氏艾美耳球蟲(chóng)病毒作為一種轉(zhuǎn)染載體，攜帶外源基因在其體內(nèi)表達(dá)。
[0010]實(shí)施例2
含紅色熒光蛋白(RFP)的斯氏艾美耳球蟲(chóng)病毒RNA轉(zhuǎn)染載體的構(gòu)建
如附圖1B所示，根據(jù)斯氏艾美耳球蟲(chóng)病毒(EsRVl)基因組dsRNA的序列特征，將紅色焚光蛋白(red fluorescent protein，RFP)基因替換dsRNA的第452位到5985位核酸序列，構(gòu)建EsRVl與RFP的嵌合體。用PCR擴(kuò)增反應(yīng)將T7啟動(dòng)子引入到dsRNA cDNA的5’非編碼區(qū)的前端的同時(shí)，用PCR方法從EsRVl dsRNA cDNA擴(kuò)增EsRVl的5’端451bp (包括5’ UTRs)，3’端234bp (包括3’ UTRs)及從實(shí)驗(yàn)室保存的pMD18_T-Red質(zhì)粒擴(kuò)增RFP編碼區(qū)序列(675bp)。將三個(gè)片段分別克隆到PMD18-T載體上，得到重組質(zhì)粒pEsRV451-RFP-pEsRV234。重組質(zhì)粒 pEsRV451_RFP_pEsRV234 經(jīng) PCR 擴(kuò)增后，PCR 產(chǎn)物凝膠回收，定量后作為模板，應(yīng)用 T7 RiboMAX? Express Large Scale RNA Product1n System進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。將pEsRV451-RFP-pEsRV234體外轉(zhuǎn)錄體RNA加入斯氏艾美耳球蟲(chóng)未孢子化卵囊Cytomix溶液中，終體積為100 μ I,使用BTX電轉(zhuǎn)杯，以電壓500V、脈沖時(shí)間0.3ms間隔10rns連續(xù)進(jìn)行三次電擊反應(yīng)。冰浴20min之后，將未孢子化卵囊轉(zhuǎn)移至24孔板中，加入適量的重鉻酸鉀，于28.5°C溫箱中進(jìn)行孢子化。提取pEsRV451-RFP-pEsRV234株孢子化卵囊的dsRNA，以此為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增RFP基因。同時(shí)提取孢子化后的蟲(chóng)體蛋白進(jìn)行Western blot分析。結(jié)果均可檢測(cè)到紅色熒光蛋白的表達(dá)(見(jiàn)附圖2B)。說(shuō)明可以利用斯氏艾美耳球蟲(chóng)病毒作為一種轉(zhuǎn)染載體，攜帶外源基因在其體內(nèi)表達(dá)。
[0011] 實(shí)施例3
含綠色熒光蛋白(EGFP)及紅色熒光蛋白(RFP)的斯氏艾美耳球蟲(chóng)病毒RNA轉(zhuǎn)染載體的構(gòu)建
如附圖1C所示，根據(jù)斯氏艾美耳球蟲(chóng)病毒(EsRVl)基因組dsRNA的序列特征，將綠色熒光蛋白(EGFP)基因替換dsRNA的第452位到2719位核酸序列，將紅色熒光蛋白(RFP)基因替換dsRNA的第2871位到5985位核酸序列，構(gòu)建EsRVl與GFP及RFP的嵌合體。用PCR擴(kuò)增反應(yīng)將T7啟動(dòng)子引入到dsRNA cDNA的5’非編碼區(qū)的前端的同時(shí)，用PCR方法從EsRVldsRNA cDNA 擴(kuò)增 EsRVl 的 5’端 451bp (包括 5’UTRs)，3’端 234bp (包括 3’UTRs)，EGFP 編碼區(qū)及RFP編碼區(qū)四個(gè)片段，構(gòu)建EsRVl與GFP及RFP的嵌合體，并分別克隆到pMD18_T載體上，得到重組質(zhì)粒 pEsRV451-EGFP-RFP-pEsRV234。重組質(zhì)粒 pEsRV451_EGFP-RFP_pEsRV234經(jīng)PCR擴(kuò)增后，PCR產(chǎn)物凝膠回收，定量后作為模板，應(yīng)用T7 RiboMAX? Express LargeScale RNA Product1n System 進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。將 pEsRV451_EGFP-RFP_pEsRV234 體外轉(zhuǎn)錄體RNA加入斯氏艾美耳球蟲(chóng)未孢子化卵囊Cytomix溶液中，終體積為100 μ 1，使用BTX電轉(zhuǎn)杯，以電壓500V、脈沖時(shí)間0.3ms間隔10ms連續(xù)進(jìn)行三次電擊反應(yīng)。冰浴20min之后，將未孢子化卵囊轉(zhuǎn)移至24孔板中，加入適量的重鉻酸鉀，于28.5°C溫箱中進(jìn)行孢子化。提取pEsRV451-EGFP-RFP-pEsRV234株孢子化卵囊的dsRNA，以此為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增EGFP及RFP基因。同時(shí)提取孢子化后的蟲(chóng)體蛋白進(jìn)行Western blot分析。結(jié)果均可檢測(cè)到綠色熒光蛋白及紅色熒光蛋白的表達(dá)(見(jiàn)附圖2C)。說(shuō)明可以利用斯氏艾美耳球蟲(chóng)病毒作為一種轉(zhuǎn)染載體，攜帶外源基因在其體內(nèi)表達(dá)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種斯氏艾美耳球蟲(chóng)病毒核酸的CDNA序列，其基因序列如SEQ n0.1所示。2.斯氏艾美耳球蟲(chóng)病毒RNA為載體的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，其特征在于:將含外源基因和多克隆酶切位點(diǎn)的基因替換斯氏艾美耳球蟲(chóng)病毒dsRNA的第452位到5985位核酸序列，并用PCR反應(yīng)在5’非編碼區(qū)前端引入T7啟動(dòng)子，構(gòu)建出可在斯氏艾美耳球蟲(chóng)未孢子化卵囊體內(nèi)進(jìn)行外源基因表達(dá)的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了斯氏艾美耳球蟲(chóng)病毒的核酸序列，同時(shí)還提供斯氏艾美耳球蟲(chóng)體內(nèi)表達(dá)外源基因的一種RNA轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，所述的耳球蟲(chóng)病毒基因組dsRNA全長(zhǎng)cDNA序列6219bp。所構(gòu)建的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)含有多克隆酶切位點(diǎn)，方便外源基因在斯氏艾美耳球蟲(chóng)體內(nèi)的表達(dá)。該病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)的構(gòu)建，為研究斯氏艾美耳球蟲(chóng)基因功能和生物學(xué)特性提供了有利的工具。
【IPC分類(lèi)】C12R1/93, C12N15/86, C12N15/40
【公開(kāi)號(hào)】CN104962568
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510350464
【發(fā)明人】張西臣, 信彩巖, 武斌, 才學(xué)鵬, 李建華, 宮鵬濤, 楊舉, 李 赫, 張楠, 尹繼剛
【申請(qǐng)人】吉林大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年10月7日
【申請(qǐng)日】2015年6月24日