小鼠胚胎成纖維細胞nih/3t3電轉染的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于轉基因技術中細胞轉染領域，尤其涉及一種小鼠胚胎成纖維細胞NIH/3T3 (以下簡稱NIH/3T3細胞)電轉染的方法。
【背景技術】
[0002]NIH/3T3是從NIH Swiss小鼠胚胎培養(yǎng)物中建立的高度接觸抑制的連續(xù)細胞株。為了培育在形態(tài)學特征上更適合于進行轉化分析的亞株，建立的NIH/3T3細胞株又進行了五輪以上亞克隆。這株細胞對DNA轉化及轉染研宄十分有用。
[0003]NIH/3T3細胞通常采用脂質體轉染方法，操作周期為兩天，然而，脂質體試劑本身較為昂貴，且?guī)в卸拘裕矔毎纳砘顒釉斐捎绊?。病毒轉染方法的準備程序復雜，常常用于難轉染的細胞，在一般實驗室中很難普及，且價格不菲，改造后病毒仍然可能具有侵染性，需考慮安全因素。DEAE-葡聚糖法是帶正電的DEAE-葡聚糖與核酸帶負電的磷酸骨架相互作用形成的復合物被細胞內吞，適應細胞的種類有局限性，操作復雜，對細胞也有一定的毒性。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種操作簡便快捷、對細胞毒性小且轉染效率高的小鼠胚胎成纖維細胞NIH/3T3電轉染的方法。
[0005]為解決上述技術問題，本發(fā)明采用以下技術方案:小鼠胚胎成纖維細胞NIH/3T3電轉染的方法，采用低滲透壓的電轉染緩沖液，對小鼠胚胎成纖維細胞NIH/3T3進行一次放電；電轉染緩沖液的滲透壓為90?280m0smol/kg，一次放電的電壓為710?1100V，持續(xù)時間為45?75 μ S。
[0006]電轉染緩沖液的滲透壓為200?280m0smol/kg。
[0007]一次放電的電壓為700?800V或800?900V或900?1000V或1000?1100V，
持續(xù)時間為75 μ S。
[0008]電轉染緩沖液的滲透壓為280m0smol/kg，一次放電的電壓為710V或810V或910V或1100V，持續(xù)時間為75 μ S。
[0009]電轉染緩沖液由等滲透壓溶液配制而成；等滲透壓溶液組成為KCl 25mM、KH2PO40.3mM、K2HPO40.85mM、肌醇 280m0smol/kg，ρΗ7.I ?7.3，電導率，25 度 3.2 ?3.8mS/cm ο
[0010]電轉染是一種方便簡捷的細胞轉染方法，只需普通緩沖鹽溶液即可，周期短，操作只需一天，不會對細胞產生強大的毒副作用。針對脂質體轉染、病毒轉染和DEAE-葡聚糖法的周期長、成本高、操作繁瑣的問題，發(fā)明人結合電轉染的上述優(yōu)點，建立了一種小鼠胚胎成纖維細胞NIH/3T3電轉染的方法，該法主要采用等滲透壓的電轉染緩沖液，對小鼠成纖維細胞NIH/3T3進行一次放電，通過等滲透壓和高壓脈沖電場壓組合，使得細胞體積增大，高脈沖電壓破壞細胞膜電位，DNA通過膜上形成的小孔導入細胞質中，從而提高電轉效率。實際試驗表明，應用本發(fā)明質粒pmaxGFP(綠色熒光蛋白)轉染到小鼠成纖維細胞NIH/3T3，轉染效率最高可以達到55%左右。本發(fā)明可以縮短試驗周期，節(jié)約成本，減少繁瑣的操作步驟，并且安全無害，為小鼠成纖維細胞NIH/3T3細胞系的后續(xù)研宄提供了關鍵的技術支持。
【附圖說明】
[0011]圖1是脂質體轉染NIH/3T3細胞的熒光顯微鏡圖。
[0012]圖2是脂質體轉染NIH/3T3細胞不加質粒的陰性對照的熒光顯微鏡圖。
[0013]圖3是本發(fā)明電轉染(710V)NIH/3T3細胞的熒光顯微鏡圖。
[0014]圖4是本發(fā)明電轉染(810V)NIH/3T3細胞的熒光顯微鏡圖。
[0015]圖5是本發(fā)明電轉染(910V)NIH/3T3細胞的熒光顯微鏡圖。
[0016]圖6是本發(fā)明電轉染(1100V)NIH/3T3細胞的熒光顯微鏡圖。
[0017]圖7是各種不同條件下轉染進綠色熒光蛋白的細胞占總細胞的比例的柱狀圖。
【具體實施方式】
[0018]采用傳統(tǒng)的脂質體轉染和本發(fā)明電轉染方法的轉染率進行對比，同時設置不轉質粒的組作為陰性對照。
[0019]一、小鼠成纖維細胞NIH/3T3電轉染的方法
[0020]試驗方法:通過本發(fā)明電轉染方法將AMAXA公司的貨號為VPA1001的pmaxGFP (綠色熒光蛋白)質粒轉染到小鼠成纖維細胞NIH/3T3，采用熒光顯微鏡拍照計算發(fā)綠色熒光數(shù)目的細胞以分析轉染效率。試驗中包括了對細胞實施四種不同電壓，采取相同滲透壓的緩沖液以及相同脈沖時長的放電時間。
[0021]試驗設備:型號eppendorf multiporator，貨號 4308CG831520。
[0022]電轉染方法:采用等滲透壓的電轉染緩沖液，對小鼠成纖維細胞NIH/3T3進行一次放電；電轉染緩沖液的滲透壓為280m0smol/kg，一次放電的電壓分別為710V、810V、910V、1100V，持續(xù)時間為 75 μ S。等滲透壓溶液組成為:KCl,25mM ；KH2P04,0.3mM ；K2HPO40.85mM ;肌醇 280m0smol/kg，ρΗ7.I ?7.3，電導率，25 度 3.2 ?3.8mS/cm。
[0023]具體試驗步驟如下:
[0024]在指數(shù)時期收集細胞，用280m0smol/kg滲透壓的等滲緩沖液稀釋細胞，并加入pmaxGFP質粒，使其終密度約為2x 16ce 11 s/ml，質粒終濃度為20 μ g/ml ;分裝到四個400 μ 1，直徑為2mm的電轉杯后，按以下要求施加電壓；
[0025]第一次條件為:電壓710V，滲透壓280m0smol/kg，持續(xù)時間75 μ s ;
[0026]第二次條件為:電壓810V，滲透壓280m0smol/kg，持續(xù)時間75 μ s ;
[0027]第三次條件為:電壓910V，滲透壓280m0smol/kg，持續(xù)時間75 μ s ;
[0028]第四次條件為:電壓1100V，滲透壓280m0smol/kg，持續(xù)時間75 μ S。
[0029]二、小鼠成纖維細胞ΝΙΗ/3Τ3脂質體轉染方法
[0030]在孔板中先培養(yǎng)細胞，待其密度約為2X106cellS/ml時，開始進行脂質體轉染，將I μ g的質粒和I μ I的脂質體分別加入50 μ I的optin-DMEM培養(yǎng)基中，靜置5min ;混合均勻后室溫靜置20min，然后加入到孔板中；用optin-DMEM培養(yǎng)基補足剩余的培養(yǎng)基，6h后換液。第二天觀察結果。
[0031]三、實驗數(shù)據(jù)及結果
[0032]如圖1至7所示，傳統(tǒng)脂質體轉染效率在40%左右，而采用本發(fā)明方法隨著電壓不斷地增高，NIH/3T3細胞的轉染效率呈梯度增高趨勢，當電壓為710V時，轉染效率達到10%左右，當電壓為81V時，轉染效率達到20%左右，當電壓91V時，轉染效率達到50%左右，當電壓為1100V時，轉染效率達到55%左右，超過脂質體轉染效率。
[0033]通過對比數(shù)據(jù)可知，本發(fā)明通過高壓脈沖電場和等滲透壓組合的方式，在對細胞施加不同電壓后，外源DNA分子進入細胞質的數(shù)量呈遞增趨勢，在電壓1100V的條件下，NIH/3T3細胞轉染pmax(綠色熒光蛋白)細胞學實驗結果的轉染效率超過脂質體轉染效率，達到55%左右。試驗周期短，成本節(jié)約，操作簡捷，安全無害，為NIH/3T3下一步試驗研宄提供便捷條件。
【主權項】
1.一種小鼠胚胎成纖維細胞NIH/3T3電轉染的方法，其特征在于采用等滲透壓的電轉染緩沖液，對小鼠胚胎成纖維細胞NIH/3T3進行一次放電；所述電轉染緩沖液的滲透壓為280m0smol/kg，一次放電的電壓為710?1100V，持續(xù)時間為45?75 μ S。2.根據(jù)權利要求1所述的小鼠胚胎成纖維細胞ΝΙΗ/3Τ3電轉染的方法，其特征在于:所述電轉染緩沖液的滲透壓為280m0smol/kg。3.根據(jù)權利要求2所述的小鼠胚胎成纖維細胞NIH/3T3電轉染的方法，其特征在于:所述一次放電的電壓為700?800V或800?900V或900?1000V或1000?1100V，持續(xù)時間為75 μ S。4.根據(jù)權利要求3所述的小鼠胚胎成纖維細胞ΝΙΗ/3Τ3電轉染的方法，其特征在于:所述電轉染緩沖液的滲透壓為280m0smol/kg，一次放電的電壓為710V或810V或910V或1100￥，持續(xù)時間為75 4 8。5.根據(jù)權利要求4所述的小鼠胚胎成纖維細胞NIH/3T3電轉染的方法，其特征在于:所述電轉染緩沖液由等滲透壓溶液配制而成；所述等滲透壓溶液組成為KCl 25mM、KH2PO40.3mM、K2HPO40.85mM、肌醇 280m0smol/kg，ρΗ7.I ?7.3，電導率，25 度 3.2 ?3.8mS/cm ο
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種小鼠胚胎成纖維細胞NIH/3T3電轉染的方法，該法主要采用等滲透壓的電轉染緩沖液，對小鼠成纖維細胞NIH/3T3進行一次放電，通過等滲透壓和高壓脈沖電場壓組合，使得細胞體積增大，高脈沖電壓破壞細胞膜電位，DNA通過膜上形成的小孔導入細胞質中，從而提高電轉效率。實際試驗表明，應用本發(fā)明質粒pmaxGFP(綠色熒光蛋白)轉染到小鼠成纖維細胞NIH/3T3，轉染效率最高可以達到55％左右。本發(fā)明可以縮短試驗周期，節(jié)約成本，減少繁瑣的操作步驟，并且安全無害，為小鼠成纖維細胞NIH/3T3細胞系的后續(xù)研究提供了關鍵的技術支持。
【IPC分類】C12N15/87
【公開號】CN104975045
【申請?zhí)枴緾N201510280081
【發(fā)明人】周磊, 鄒知明, 崔涵, 李一星
【申請人】廣西大學
【公開日】2015年10月14日
【申請日】2015年5月27日