堿蓬黃酮a及其制備方法和用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，是一種具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的新化合物一一堿 蓬黃酮 A，化學(xué)名：5, 6, 8-三甲氧基-7-羥基 coumaronochromone (5, 6, 8-trimethoxy 7-ydroxycoumaronoch- romone)的制備方法和在醫(yī)藥領(lǐng)域中的增強(qiáng)機(jī)體免疫力的用途。具 體涉及從堿蓬全草中提取分離得到的一種新化合物，該化合物對脂多糖誘導(dǎo)的脾細(xì)胞增殖 有很好的抑制活性，IC5tl可達(dá)0.39 μΜ，可用于制備治療免疫力低下疾病的藥物。
【背景技術(shù)】
[0002] 喊蓬 Swaei/a (Bunge) Bunge 為薬科Chenopodiaceae 喊蓬屬 Swaei/aForsk· ex Scop. -年生草本真鹽植物。它廣泛分布于我國新疆、山東、河北、遼寧、吉林、內(nèi)蒙古及 甘肅等地的鹽堿荒漠和沿海灘涂。已知天然存在的植物黃酮表現(xiàn)出廣泛的生物活性，包括 抗氧化、抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化、抗炎等。研宄表明，堿蓬中含有豐富的營養(yǎng)成分，堿蓬種 子脂肪含量車父尚，約占其干物質(zhì)的36. 5%，尚于大? ;喊逢鮮嫩莖葉的蛋白質(zhì)含量為40% ;除 以上營養(yǎng)成分外，堿蓬中還含有豐富人類所必需的維生素以及微量元素，堿蓬中含有大量 黃酮類化合物，但對它的化學(xué)成分研宄較少。堿蓬藥材始載于《救荒本草》，云："其葉味微 咸，性微寒"。據(jù)清代《本草綱目拾遺》記載：堿蓬"味咸性涼，清熱消積"，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研宄發(fā) 現(xiàn)，堿蓬具有抗炎、保肝、降血脂、抗衰老等藥理活性而且對老年人、高血壓病人具有一定的 保健作用，另有文獻(xiàn)報道coumaronochromone黃酮類化合物具有較好的免疫抑制活性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明提供一種具有顯著增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的新化合物一一堿蓬黃酮A的制備方 法和在醫(yī)藥領(lǐng)域中治療免疫性疾病方面的用途。
[0004] 本發(fā)明公開了該化合物的結(jié)構(gòu)式(見摘要附圖） 分子式為：C18H14O7，不飽和度為12。分子量：342。
[0005] 命名為：喊蓬黃酮A，化學(xué)名：5, 6, 8-三甲氧基_7_羥基coumaronochromone (5, 6, 8-trimethoxy-7-hydroxycoumaronochromone)〇
[0006] 本發(fā)明中上述化合物的制備方法如下： 其特征在于以8月份產(chǎn)自山東省壽光市的堿蓬為原料，經(jīng)反復(fù)通過硅膠或球形硅膠、 Sephadex LH-20 (Sep.)凝膠柱層析、反相材料ODS中的一種或幾種柱層析和重結(jié)晶等手段 分離純化得到該化合物。
[0007] 本發(fā)明的新化合物及其衍生物與醫(yī)學(xué)上可接受的藥用輔料組成藥物制劑用于免 疫力低下相關(guān)疾病?？芍苽涞膭┬陀校浩瑒?、膠囊劑、顆粒劑和注射劑。
[0008] 四、【附圖說明】： 以下圖可作為附件材料上報。
[0009] 圖1、化合物的1H-NMR譜 圖2、化合物的 13C-NMR譜 圖3、化合物的DEPT譜 圖4、化合物的1H-1H COSY的譜 圖5、化合物的HSQC譜 圖6、化合物的HMBC譜 圖7、化合物的ROESY譜 圖8、化合物的ES I-MS譜 五、【具體實施方式】： 結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不僅僅限于所列舉的實 施方式。
[0010] 實施例1.從堿蓬全草中分離和鑒定該新化合物 堿蓬干燥全草約10 Kg，粉碎，經(jīng)80%乙醇加熱回流提取3次，濃縮，得到總浸膏，依次經(jīng) 石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等體積萃取3次，得乙酸乙酯部位浸膏180 g，經(jīng)硅膠柱層析，石 油醚-乙酸乙酯-甲醇梯度洗脫，共收集11個流份，流份6反復(fù)經(jīng)硅膠柱、S印hadex LH-20 柱、反相柱層析從堿蓬干燥全草乙醇提取物中得到該單體化合物，通過理化性質(zhì)、波譜方法 鑒定為堿蓬黃酮A，經(jīng)文獻(xiàn)檢索該化合物是新化合物。
[0011] 該化合物結(jié)構(gòu)經(jīng)核磁共振譜鑒定如下： 無色針狀結(jié)晶，易溶于氯仿、甲醇等有機(jī)溶劑。用TLC法顯示紫外365nm下無明顯熒光， 在254nm紫外燈光下有暗斑，噴濃硫酸-香草醛顯色劑并加熱后顯亮黃色，噴FeCl3顯污綠 色，Molish 和 Liebermann-Burchard 反應(yīng)都呈陰性。ESI-MS (m/z):341 ([M+HF)得出其 分子量為342。結(jié)合1H-NMR和13C-NMR圖譜數(shù)據(jù)推斷SG-Il的分子式為C 18H1407，不飽和度 為12,推斷化合物是一個典型的coumaronochromone骨架類型黃酮。
[0012] 1H-NMR (500MHz，DMSO-op心:10· 54 (lH，brs)酚羥基的信號峰，心在較低場出 現(xiàn)，懷疑可能是形成了分子內(nèi)氫鍵，使其向低場方向移動，推測為7-OH取代黃酮結(jié)構(gòu)片段； 5η:8·02(1Η，^7·9，1·9Ηζ)，7·74(1Η，^7·9，1·9Ηζ)，7·45(1Η，^7·9，1·9Ηζ)，7·44 (1Η，歲7. 9,1.9Hz)推測該化合物存在AA^ BB^系統(tǒng)的4個芳香氫信號；4:3. 90 (3H，s)， 3.84 (3H，s)，3.83 (3H，s)是 3 個-OMe 的信號峰。結(jié)合 1H-1H COSY 譜和 ROESY 譜中心： 7.74 (1H，歲7. 9,1. 9 Hz)與 7.45 (1H，歲7. 9,1.9 Hz)，8.02 (1H，歲7. 9,1. 9 Hz)有相關(guān) 峰和心:7. 45 (1H，歲7. 9,1.9 Hz)與8.02 (1H，歲7. 9,1.9 Hz)有相關(guān)峰，可以推斷出存 在1'，2'-二取代芳香B環(huán)。
[0013] 13C-NMR (135MHz，DMSO-op 與 DEPT 譜結(jié)合可知有 4 個-CH 即心:125. 1，125. 0， 120. 6,111. 4 ;3 個-OMe 即心:61. 9,6L 2,6L 1 ;11 個季碳即心:172. 2,163. 5,149. 0， 148. 6,148. 5,144. 9,140. 2,132. 8,122. 9,110. 3,97· 9 ;不含有-CH2，其中心:172. 2， 163.5,97.9為典型的〇，/?-不飽和羰基碳信號。
[0014] HSQC 譜可知心:8.02 (1H，歲7. 9,1. 9 Hz)與心:120. 6 有相關(guān)峰；心:7.44( 1H， 歲7. 9,1. 9 Hz)與心:125.0 有相關(guān)峰；心:7.45 (1H，歲7. 9,1.9 Hz)，7.74 (1H，歲7. 9， 1.9 Hz)分別與心:125.1，111.4有相關(guān)峰，證實了 4個芳香氫質(zhì)子與B環(huán)的4個碳相連； 心:3· 83 (3H，s)，3. 90 (3H，s)，3. 84 (3H，s)分別與心:61· 1，61· 2,61· 9 有相關(guān)峰證明 3個-OMe的存在。
[0015] 從 HMBC 譜中心:3· 83 (3H，s)與心:140. 2 有相關(guān)峰，心:3· 84 (3H，s)，3. 90 (3札8)與心:148.6，132.8有相關(guān)峰，可知(：-5，(：-6，(：-8連接的都是-0厘6;^1:8.02(1!1， 歲7.9，1.9取)與心:125.1，120.6，111.4,97.9有相關(guān)峰和心:7.74(1!1，歲7.9，1.9取） 與心:148·5，125·1，122·9 有相關(guān)峰，心:7·45(1Η，歲 7·9，1·9Ηζ)與心:125.0，120.6， 111. 4 有相關(guān)峰和心:7.44 (1Η，歲7. 9,1.9 Hz)與心:148. 5.，125. 1，122. 9,120. 6,111. 4 有相關(guān)峰，可知C-3'，C-4'，C-5'，C-6'連接的是Η。
[0016] 綜合以上信息，推斷化合物的結(jié)構(gòu)（見摘要附圖）。將化合物結(jié)構(gòu)輸入 ScienceFinder進(jìn)行檢索，發(fā)現(xiàn)這是一個新化合物。化學(xué)名：5,6,8-三甲氧基-7-羥基 coumaronochromone (5, 6, 8-trimethoxy-7-hydroxycoumaronochromone) 〇 將其中文名命 名為：堿蓬黃酮A (suaeglaucin A)〇
[0017] Table I. 1該化合物的1H-NMR(500MHz)/3C-NMR(135MHz)的信號全歸屬及相互間 相關(guān)關(guān)系
實施例2. 免疫抑制活性實驗 1、試驗方法： (1)實驗動物 BALB/c純系小鼠，雌性，18-20克，購自中國科學(xué)院上海動物實驗中心（IA⑶C批準(zhǔn)號 2012-02-zjp-13)。
[0018] (2)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的制備： 小鼠脫頸椎處死，無菌取其脾臟，常規(guī)制備單個淋巴細(xì)胞懸液，紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì) 胞，用含2% FBS洗3次后，用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液洗1次后，將細(xì)胞濃度調(diào)至4 乘 IO6/ mL 〇
[0019] (3) MTT法檢測化合物對小鼠脾臟淋巴細(xì)胞活性的影響： 小鼠脾臟淋巴細(xì)胞懸液100 μ L (4乘IO5/孔）接種于96孔板，同時加入不同濃度的 化合物，另設(shè)相應(yīng)的溶媒對照及培養(yǎng)液本底對照，總體積為200 μ L。37°C，5% CO2培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)上清，再加入150 μ L DMSO溶解細(xì)胞，用酶標(biāo)儀于570 nm處測定OD值。
[0020] (4) 3H-TdR摻入法檢測化合物對小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖功能的影響： 小鼠脾臟淋巴細(xì)胞懸液100 μ L (4乘IO5/孔)接種于96孔板，加入50 μ L ConA (終 濃度5 μ g/mL)，或加入50 μ L的LPS (終濃度10 μ g/mL)，不同濃度化合物50 μ L，總 體積為200 μ L，每個濃度3復(fù)孔，并設(shè)相應(yīng)的無 ConA或無 LPS對照孔以及無藥物對照孔。 7°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)結(jié)束前8 h，每孔加入25 yL 3H-胸腺嘧啶核苷酸（10 μ Ci/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)至實驗結(jié)束。將細(xì)胞用細(xì)胞收集儀收集至玻璃纖維膜上，加入閃爍液后 于 Beta 計數(shù)儀（MicroBeta Trilux, PerkinElmer)讀取慘入細(xì)胞 DNA 的 3H-TdR 量，以 cpm 值代表細(xì)胞增殖的情況。
[0021] 、試驗用樣品 新化合物：堿蓬黃酮A (5, 6, 8-三甲氧基-7-羥基coumaronochromone) 3、實驗結(jié)果 Table 2.1化合物對小鼠脾臟淋巴細(xì)胞活性的影響
Table 2. 2化合物對LPS誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞增殖功能的影響
Table 2. 3化合物對ConA誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖功能的影響
4、結(jié)論 試驗結(jié)果表明，堿蓬黃酮A能顯著抑制淋巴B細(xì)胞與T細(xì)胞的增殖，表明該化合物可用 于制備免疫抑制劑，并對自身免疫性疾病，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡等具有治療作用， 同時發(fā)現(xiàn)該化合物的IC5tl值較小，SI值較大，因此，其毒副作用較小，具有較寬的治療區(qū)間。
【主權(quán)項】
1. 種黃酮類化合物，其特征在于該化合物一一堿蓬黃酮A，化學(xué)名：5, 6, 8-三甲氧 基 _7_ 羥基coumaronochromone(5, 6, 8-trimethoxy-7_hydroxycoumaronochromone)，化 學(xué)結(jié)構(gòu)式為：2. 權(quán)利要求1所述化合物的制備方法，其特征在于以堿蓬全草為原料，通過多次硅膠 柱層析，經(jīng)石油醚-乙酸乙酯溶劑系統(tǒng)或者氯仿-甲醇溶劑系統(tǒng)分離，再經(jīng)S印hadexLH-20 或0DS反相柱層析，甲醇、乙醇或者甲醇-水、乙醇-水不同比例的溶液洗脫而得。3. 權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述的柱層析用擔(dān)體選自硅膠、凝膠、反相 硅膠中的一種或幾種。4. 權(quán)利要求1所述的化合物與醫(yī)學(xué)上可接受的藥用輔料組成的藥物制劑。5. 權(quán)利要求4所述的藥物制劑，其特征在于制劑劑型為片劑、膠囊劑、顆粒劑或注射 劑。6. 權(quán)利要求1所述的化合物在制備調(diào)節(jié)力藥物方面的用途。
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種具有免疫抑制活性的黃酮類類新化合物——堿蓬黃酮A，化學(xué)名：5,6,8-三甲氧基-7-羥基coumaronochromone（5,6,8-trimethoxy-7-hydroxycoumaronochromone），結(jié)構(gòu)式如下所示。。本發(fā)明還涉及該化合物的制備方法及其該化合物對LPS及ConA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖的作用。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)堿蓬黃酮A具有很好的抑制淋巴細(xì)胞增殖的活性，IC50值可達(dá)0.39 μM，可用于制備治療免疫力相關(guān)疾病的藥物。
【IPC分類】A61K31/35, A61P29/00, C07D493/04, A61P37/02, A61P19/02
【公開號】CN104987340
【申請?zhí)枴緾N201510392889
【發(fā)明人】王奇志, 邱萍, 馮煦, 印敏, 管福琴, 單宇, 陳雨, 劉飛, 王鳴, 趙友誼, 張建華
【申請人】江蘇省中國科學(xué)院植物研究所
【公開日】2015年10月21日
【申請日】2015年7月7日