一種穩(wěn)定、抗干擾能力強(qiáng)的α-羥丁酸脫氫酶試劑及檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及a-哲了酸脫氨酶檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域,特別設(shè)及一種a-哲了酸脫氨酶檢 測(cè)試劑,還設(shè)及使用此檢測(cè)試劑的檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] a-哲了酸脫氨酶(a-皿DH),屯、肌酶譜中酶的一種,實(shí)質(zhì)上是LD化型同功酶,主 要來(lái)源于屯、肌、腎臟和紅細(xì)胞,在屯、肌中含量最豐富。a-哲了酸脫氨酶活性的測(cè)定常用于 急性屯、肌梗死(AMI)輔助診斷,為Affl的臨床診斷、病情觀察、療效分析和愈后估計(jì)提供了 有力的定量指標(biāo)。其測(cè)定對(duì)Affl的診斷比LDH更為專一,更有價(jià)值。此外,a-哲了酸脫氨 酶增高主要見(jiàn)于屯、肌梗塞、活動(dòng)性風(fēng)濕性屯、肌炎、急性病毒性屯、肌炎、溶血性貧血等。
[0003] a-哲了酸脫氨酶(a-皿DH)常用的測(cè)定方法主要有比色法和連續(xù)監(jiān)測(cè)法。比色 法是W前較為常用的檢測(cè)方法,該法利用a-HBDH作用于過(guò)量的a-酬了酸生成a-哲了 酸,則剩余者與2,4-二硝基苯阱形成a-酬了酸苯腺,在堿性溶液中呈棟色,其顏色深淺與 酶活性成反比。該法操作簡(jiǎn)單,但試劑存在污染性較大,易受其他物質(zhì)干擾等缺點(diǎn)。連續(xù)監(jiān) 測(cè)法是目前較為常用的方法,利用a-HBDH催化a-酬了酸還原成a-哲了酸,同時(shí)使NADH 氧化成NAD,在340nm監(jiān)測(cè)NADH的氧化速率與該酶活性成正比。該法簡(jiǎn)便快速、適用于全自 動(dòng)生化分析,但該法試劑底物NADH穩(wěn)定性不佳,需進(jìn)一步改進(jìn)穩(wěn)定性。
[0004] 鑒于此,本發(fā)明在連續(xù)監(jiān)測(cè)法的基礎(chǔ)上,優(yōu)化反應(yīng)體系,采用PIPES緩沖液,添加 多種抗干擾物質(zhì)和穩(wěn)定劑,顯著改善了試劑的抗干擾能力和穩(wěn)定性。是一種更加穩(wěn)定、抗干 擾能力強(qiáng)的a-哲了酸脫氨酶(a-HBDH)試劑。
【發(fā)明內(nèi)容】
[000引本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測(cè)a-哲了酸脫氨酶(a-HBDH)的試劑及使用 該試劑檢測(cè)a-哲了酸脫氨酶活性的方法。該試劑盒采用連續(xù)監(jiān)測(cè)法,可W有效檢測(cè)a-哲 了酸脫氨酶的活性,抗干擾能力強(qiáng),穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。
[0006] 本發(fā)明的基本原理: a-HBDH催化a-酬了酸還原成a-哲了酸,同時(shí)使NADH氧化成NAD,在340皿監(jiān)測(cè)NADH的氧化速率與該酶活性成正比。
[0007] 本發(fā)明是通過(guò)W下步驟得到的: 一種a-哲了酸脫氨酶檢測(cè)試劑,包括試劑R1和試劑R2,所述試劑R1和試劑R2的組 成如下:
[0008] 所述的a-哲了酸脫氨酶檢測(cè)試劑,試劑R1中緩沖液為25°C,抑為7. 4的嗽 嗦-1,4-二己橫酸緩沖液。
[0009] 所述的a-哲了酸脫氨酶檢測(cè)試劑,試劑R2中緩沖液為25°C,抑為7. 4的嗽 嗦-1,4-二己橫酸緩沖液。
[0010] 所述的a-哲了酸脫氨酶檢測(cè)試劑,所述防腐劑為NaNs。
[0011] 所述的a-哲了酸脫氨酶檢測(cè)試劑來(lái)檢測(cè)a-哲了酸脫氨酶活性的檢測(cè)方法,使 用全自動(dòng)生化分析儀利用速率法進(jìn)行測(cè)定,檢測(cè)主波長(zhǎng)為340nm。
[0012] 所述的檢測(cè)方法,R1試劑和R2試劑的比例為4:1。
[0013] 本發(fā)明的有益效果: 1) 采用新的緩沖體系和穩(wěn)定劑,可W防止底物NADH氧化,顯著改善了試劑的穩(wěn)定性; 2) 采用兩性表面活性劑十二烷基二甲基甜菜堿,不僅顯著改善測(cè)定的性能,而且增強(qiáng) 了試劑的穩(wěn)定性和抗干擾能力; 3)試劑的準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性良好,價(jià)格便宜,使用方便,完全可W滿足臨床需要。
【附圖說(shuō)明】
[0014] 圖1為兩種試劑的相關(guān)性曲線圖。
[0015] 圖2為兩種試劑有效期穩(wěn)定性曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明。
[0017] 實(shí)施例1 a-哲了酸脫氨酶的檢測(cè)試劑,包試劑R1和試劑R2 : 1)其R1的組成為:
[001引 3 )本實(shí)施例試劑的使用方法; 本實(shí)施例描述的a-哲了酸脫氨酶檢測(cè)試劑,在使用時(shí)采用具有雙試劑功能的全自動(dòng) 生化分析儀,如日立7180全自動(dòng)分析儀等,利用速率法進(jìn)行測(cè)定。將R1和R2按照4:1的 比例放置到對(duì)應(yīng)的試劑位上,在樣品盤(pán)的對(duì)應(yīng)位置放置好蒸饋水、標(biāo)準(zhǔn)品和樣本,操作如表 1 : 表1實(shí)施例1試劑檢測(cè)方法
計(jì)算;a-哲了酸脫氨酶活性(U/L) =(AA測(cè)定-AA標(biāo)準(zhǔn))XC標(biāo)準(zhǔn)。
[001引實(shí)施例2 干擾性試驗(yàn) 取新鮮混合血清,分成2等份,然后將每等份再分成4等份,加入不同的干擾物質(zhì),使 其在血清中的濃度達(dá)到表2的要求。然后分別用實(shí)施例1所得試劑,與市場(chǎng)常見(jiàn)并認(rèn)可的 a-哲了酸脫氨酶(a-HBDH)試劑同時(shí)對(duì)比測(cè)定血清中a-HBDH的活性,對(duì)照組測(cè)定結(jié)果與 加入不同干擾物質(zhì)后各組的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。相對(duì)偏差(%) = (干擾樣本的測(cè)定均值一對(duì)照 樣本的測(cè)定均值)/對(duì)照樣本的測(cè)定均值X100%。
[0020] 由表2可W看出,實(shí)施例1試劑在抗壞血酸《SOmgML、膽紅素《1026ymol/L、甘 油S醋《2000mgAlL對(duì)測(cè)試結(jié)果沒(méi)有明顯干擾。而對(duì)照組試劑在上述濃度干擾物質(zhì)存在 時(shí),受到明顯干擾,該說(shuō)明通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)緩沖體系、添加兩性表面活性劑后,實(shí)施例1試劑 的抗干擾性能顯著提高,遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于對(duì)比試劑。
[0021] 表2實(shí)施例試劑抗干擾性能比較
[00過(guò)實(shí)施例3 相關(guān)性實(shí)驗(yàn) 利用實(shí)施例1配方配制試劑,與市場(chǎng)常見(jiàn)的國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局認(rèn)可的某公司的a-哲了酸脫氨酶試劑盒進(jìn)行對(duì)照檢測(cè),同時(shí)檢測(cè)了 20個(gè)臨床血清樣本,檢測(cè)結(jié)果如表3所 示。并獲得了兩種試劑的相關(guān)性曲線咖圖1所示),通過(guò)檢測(cè)結(jié)果顯示,兩個(gè)試劑盒的相關(guān) 系數(shù)為0. 9994,說(shuō)明了兩者有極大的相關(guān)性。
[0023]表3實(shí)施例1試劑與市場(chǎng)常見(jiàn)并得到認(rèn)可的a-哲了酸脫氨酶測(cè)定試劑盒對(duì)比檢 測(cè)結(jié)果
[0024]實(shí)施例4 試劑的穩(wěn)定性對(duì)比試驗(yàn) 對(duì)實(shí)施例1中的試劑,均勻分裝13組,每組的試劑量為R1為20mL,R2為5mL ;并且取13 組市場(chǎng)常見(jiàn)的國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局認(rèn)可的某公司的a-哲了酸脫氨酶(a-皿DH)試 劑盒作對(duì)照。放置到2-8°C冰箱中,每月的同一天取出一組試劑檢測(cè)a-HBDH質(zhì)控品(祀值 為260U/L),檢測(cè)結(jié)果如圖2所示,實(shí)施例1試劑在2-8°C儲(chǔ)存條件下比市場(chǎng)常見(jiàn)的a-哲 了酸脫氨酶(a-HBDH)測(cè)定試劑盒更加穩(wěn)定。
[00巧]通過(guò)驗(yàn)證,本試劑與同類(lèi)檢測(cè)試劑對(duì)比相關(guān)性好,臨床檢測(cè)樣本結(jié)果一致,能夠達(dá) 到市場(chǎng)對(duì)產(chǎn)品的應(yīng)用要求,并且抗干擾性能好,是一種更加穩(wěn)定、良好的a-哲了酸脫氨酶 (a-HBDH)檢測(cè)試劑。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種a -羥丁酸脫氫酶檢測(cè)試劑,其特征在于包括試劑Rl和試劑R2,所述試劑Rl 和試劑R2的組成如下: 試劑Rl中含有 緩沖液...................................................50mmol/L, 乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na).................................3mmol/L, a _ 酉同丁酸................................................Smmol /T,, 十二烷基二甲基甜菜堿.......................................2g/L, 防腐劑...................................................〇? 5g/L ; 2)試劑R2的組分為: 緩沖液..................................................50mmol/L, NADH...................................................0? 3mmol/L, BSA....................................................lg/L, 鹿糖...................................................l〇g/L, 海藻糖.................................................3g/L, 甘露醇................................................l〇g/L, 十二烷基二甲基甜菜堿.....................................2g/L, 防腐劑...................................................0.5g/L。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的a _羥丁酸脫氫酶檢測(cè)試劑,其特征在于試劑Rl中緩沖液為 25°C,pH為7. 4的哌嗪-1,4-二乙磺酸緩沖液。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的a _羥丁酸脫氫酶檢測(cè)試劑,其特征在于試劑R2中緩沖液為 25°C,pH為7. 4的哌嗪-1,4-二乙磺酸緩沖液。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的a _羥丁酸脫氫酶檢測(cè)試劑,其特征在于試劑Rl和R2中表 面活性劑為十二烷基二甲基甜菜堿。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的a -羥丁酸脫氫酶檢測(cè)試劑,其特征在于所述防腐劑為NaN3。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的a _羥丁酸脫氫酶檢測(cè)試劑來(lái)檢測(cè)a _羥丁酸脫氫酶的檢測(cè) 方法,其特征在于使用全自動(dòng)生化分析儀利用速率法進(jìn)行測(cè)定,檢測(cè)主波長(zhǎng)為340nm。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測(cè)方法,其特征在于Rl試劑和R2試劑的比例為4:1。
【專利摘要】本發(fā)明涉及α-羥丁酸脫氫酶檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域,特別涉及一種α-羥丁酸脫氫酶檢測(cè)試劑,試劑R1中含有緩沖液,乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na),α-酮丁酸,十二烷基二甲基甜菜堿,防腐劑;試劑R2中含有緩沖液,NADH,BSA,蔗糖,海藻糖,甘露醇,十二烷基二甲基甜菜堿,防腐劑。采用PIPES(哌嗪-1,4-二乙磺酸)緩沖液,添加穩(wěn)定劑BSA,蔗糖,海藻糖,甘露醇,大大增強(qiáng)了試劑的穩(wěn)定性;采用兩性表面活性劑十二烷基二甲基甜菜堿,不僅顯著改善測(cè)定的性能,而且增強(qiáng)了試劑的穩(wěn)定性和抗干擾能力。
【IPC分類(lèi)】C12Q1/32
【公開(kāi)號(hào)】CN104988207
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510403864
【發(fā)明人】甘宜梧, 李志明, 譚柏清, 李靜, 王綺
【申請(qǐng)人】山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司
【公開(kāi)日】2015年10月21日
【申請(qǐng)日】2015年7月11日