一種與中華絨螯蟹體重相關(guān)的snp標(biāo)志及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，設(shè)及一種與中華絨馨蟹體重相關(guān)的SNP標(biāo)志及其應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 中華絨馨蟹巧riocheirsisensis)又稱為河蟹，是長江中下游地區(qū)重要的水產(chǎn)養(yǎng) 殖對象。自然條件下，河蟹一般為2年生，每年秋季成蟹徊游到出海的河口交配、產(chǎn)卵，第 二年3~5月解化，發(fā)育成幼蟹（大眼幼體、仔蟹、蟹種）后，再溯江河而上，在淡水中繼續(xù) 發(fā)育長大為成蟹。一般而言，在河蟹養(yǎng)殖過程放養(yǎng)較大規(guī)格（體重）的蟹種可W獲得較大 的成蟹捕拱規(guī)格。因此，在河蟹苗種培育過程中，大規(guī)格蟹種的市場需求一直較大，養(yǎng)殖效 益通常較好，其價格也相應(yīng)最高。在之前的研究中，已有許多研究者嘗試從蟹種培育池形狀 (面積）、蟹苗投放密度、飼料投喂、水質(zhì)調(diào)控、水草種植等各個方面探討大規(guī)格蟹種的培育 模式，目前國內(nèi)外尚未見蟹種規(guī)格（體重）相關(guān)分子標(biāo)記開發(fā)及應(yīng)用的相關(guān)報道。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0003] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的上述空白，提供一種與中華絨馨蟹（蟹種）體重 相關(guān)的SNP標(biāo)志及其應(yīng)用。
[0004] 本發(fā)明的另一目的是提供該SNP標(biāo)志的分子標(biāo)記及其引物和應(yīng)用。 陽〇化]本發(fā)明的目的可通過W下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0006] 與中華絨馨蟹體重相關(guān)的SNP標(biāo)記，所述SNP標(biāo)記位于河蟹蟻皮抑制激素基因MIH 的5'-側(cè)翼區(qū)，具體位置為MIH基因的372bp處，堿基變異信息為SNP g. 372T〉C，該SNP位 點(diǎn)與中華絨馨蟹蟹種的體重性狀之間存在著顯著的相關(guān)性，其中CC基因型個體的平均體 重顯著高于TT基因型個體的平均體重；所述的MIH基因Genbank檢索號為AY310313。
[0007] 一種基于所述的SNP標(biāo)記開發(fā)分子標(biāo)記的方法，W含有所述的SNP標(biāo)記的核巧酸 序列為基礎(chǔ)序列，設(shè)計(jì)引物對，W中華絨馨蟹基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使所述的SNP 標(biāo)記轉(zhuǎn)化為分子標(biāo)記。
[0008] 其中，所述的引物對序列為上游引物：SEQ ID NO :2,下游引物：SEQ ID NO :3 ;所述 的分子標(biāo)記序列如SEQ ID NO :1所示，所述的SNP位點(diǎn)位于第126位，存在T/C多態(tài)性。
[0009] 按照上述的方法得到的分子標(biāo)記。
[0010] 所述的分子標(biāo)記序列優(yōu)選如SEQ ID NO : 1所示，所述的SNP位點(diǎn)位于第126位，存 在T/C多態(tài)性。 W11] -種用于檢測本發(fā)明所述的SNP標(biāo)記的引物對，上游引物為：SEQ ID NO :2,下游 引物為：SEQ ID NO :3。
[0012] 一種檢測所述的SNP標(biāo)記的方法，包含PCR擴(kuò)增中華絨馨蟹基因組中含有本發(fā)明 所述的SNP標(biāo)記的一段序列，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，判讀該位點(diǎn)的T/C多態(tài)性。
[0013] 所述的方法優(yōu)選包括W下步驟：
[0014] (1)取中華絨馨蟹的腿部肌肉并提取基因組DM ;
[001引 似用已提取的中華絨馨蟹基因組DNA為模板，使用權(quán)利要求6所述的引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增；
[0016] (3)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用MboII限制性內(nèi)切酶對所得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，分析 酶切結(jié)果，根據(jù)酶切結(jié)果判斷在SEQ ID NO :1第126位的T/C多態(tài)性。
[0017] 本發(fā)明所述的SNP標(biāo)記、分子標(biāo)記、引物在選育大規(guī)格中華絨馨蟹新品種中的應(yīng) 用。
[0018] 一種選育大規(guī)格中華絨馨蟹新品種的方法，包括檢測中華絨馨蟹MIH基因的 372bp處的基因型，選育該核巧酸位點(diǎn)為CC型的個體作為親蟹。
[0019] 有益效果：
[0020] 河蟹等甲殼動物的生長是跳躍式的，通過蟻皮才能生長，蟻皮過程與其發(fā)育、生 長、繁殖、附肢再生等重要生理過程密切相連。本發(fā)明W河蟹蟻皮抑制激素基因（MIH)上 的單核巧酸多態(tài)位點(diǎn)為研究目標(biāo)，發(fā)現(xiàn)位于MIH基因5' -側(cè)翼區(qū)的一個SNP位點(diǎn)（SNP g. 372T〉C)與蟹種的體重性狀之間存在著顯著的相關(guān)性，其中CC基因型個體的平均體重顯 著高于TT基因型（P<0. 05)個體。在W規(guī)格（體重）為選育指標(biāo)的河蟹遺傳育種研究過程 中，通過對河蟹育種群體進(jìn)行SNP g. 372T乂基因分型，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征分析，可W優(yōu)先選擇 基因型為CC的個體作為育種親本，本研究對于選育大規(guī)格河蟹新品種具有重要的指導(dǎo)意 義。
【附圖說明】 陽02U 圖1. SNP g. 372T乂的基因分型圖譜W及PCR產(chǎn)物直接測序驗(yàn)證圖譜
[0022] 注：采用PCR-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP)的方法進(jìn)行基因分型，并通過 PCR產(chǎn)物直接測序的方法加W確認(rèn)。電泳圖譜中1號泳道為CC基因型，2號泳道為TT基因 型，3號泳道為CT基因型。
【具體實(shí)施方式】 陽〇2引實(shí)施例1
[0024] 采集處于同樣培育條件下的不同規(guī)格蟹種300只W上，測量每只蟹種的外部形態(tài) 指標(biāo)，其平均體重為：8. 26 + 3. 29g。從中隨機(jī)取170只蟹種，取其腿部肌肉，采用酪氯仿法 提取其基因組DNA，采用WPCR為基礎(chǔ)的限制性片段長度多態(tài)法（PCR-RFL巧對所有蟹種個 體進(jìn)行基因分型。 陽0巧]①PCR反應(yīng)
[0026] PCR產(chǎn)物擴(kuò)增長度為224bp，PCR引物為：
[0027] 上游引物：5' -GCTTCAACAGGGGAACAGTC-3'（沈Q ID NO. 2);
[0028] 下游引物：5' -TTAGTTTGAGGACGCACGTG-3'（沈Q ID NO. 3)。
[0029] PCR擴(kuò)增序列信息如SEQ ID NO. 1所示，其中第126位存在T/C多態(tài)性。
[0030] PCR 反應(yīng)體系女曰下：10XPCR Buffer 6. 25yL，Mg化(2. 5mmol/L)6. 25yL， dNTP(2. 5mmol/L)3. 75 y L 正反向引物各 1 y L(10nmol/L)，Taq 酶 0. 5U，DNA 模板 1 y L (lOOng/ y U，雙蒸水補(bǔ)足體積至50 y L。
[0031] PCR反應(yīng)共計(jì)30個循環(huán)，循環(huán)前94°C預(yù)變性5min，每個循環(huán)包括94°C變性30s， 60°C退火30s，72°C延伸60s ;循環(huán)結(jié)束后于72°C延伸5min。
[0032] 擴(kuò)增產(chǎn)物用1. 5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，檢測合格后的PCR產(chǎn)物于-20°C保 存用于后續(xù)的酶切反應(yīng)。
[0033] ②酶切條件
[0034] 采用MboII限制性內(nèi)切酶對所得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶化酶切體系包括10X肥B 緩沖液1 y LPCR產(chǎn)物5 y LMboII 0. 25 y L雙蒸水補(bǔ)足體積至10 y L。37°C酶切過夜后用 2%的瓊脂糖凝膠電泳對酶切產(chǎn)物進(jìn)行分離，W確定各個蟹種個體的基因型。
[0035] (3)不同基因型個體與蟹種體重的相關(guān)性分析
[0036] 對基因分型成功的所有蟹種的體重進(jìn)行單因素方差分析，采用LSD法對表現(xiàn)出顯 著性差異的不同基因型蟹種的體重進(jìn)行兩兩比較，分析不同基因型與蟹種體重之間的相關(guān) 性。
[0037] 表1 MIH基因SNP g. 372T乂變異與蟹種體重的相關(guān)性
[0038]
[0039] 注：同列標(biāo)注不同的字母表示差異顯著（P<0. 05).
[0040] 結(jié)果表明，位于MIH基因5'-側(cè)翼區(qū)的一個SNP位點(diǎn)（SNP g. 372T〉C)與蟹種的體 重性狀之間存在著顯著的相關(guān)性（表1)，其中CC基因型個體的平均體重顯著高于TT基因 型個體（P<〇. 05)。
[0041] SNP g. 372T乂位點(diǎn)的PCR-RFLP基因分型及測序驗(yàn)證結(jié)果圖示見圖1。在W規(guī)格 (體重）為選育指標(biāo)的河蟹遺傳育種研究過程中，通過對河蟹育種群體進(jìn)行SNP g.372T乂 基因分型，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征分析，可W優(yōu)先選擇基因型為CC的個體作為育種親本，本研究 對于選育大規(guī)格河蟹新品種具有重要的指導(dǎo)意義。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 與中華絨螯蟹體重相關(guān)的SNP標(biāo)記，其特征在于，所述SNP標(biāo)記位于河蟹蛻皮抑制 激素基因MIH的5'-側(cè)翼區(qū)，具體位置為MIH基因的372bp處，堿基變異信息為SNP g. 372 T>C，該SNP位點(diǎn)與中華絨螯蟹蟹種的體重性狀之間存在著顯著的相關(guān)性，其中CC基因型 個體的平均體重顯著高于TT基因型個體的平均體重；所述的MIH基因Genbank檢索號為 AY310313。2. -種基于權(quán)利要求1所述的SNP標(biāo)記開發(fā)分子標(biāo)記的方法，其特征在于，以含有權(quán) 利要求1所述的SNP標(biāo)記的核苷酸序列為基礎(chǔ)序列，設(shè)計(jì)引物對，以中華絨螯蟹基因組DNA 為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使權(quán)利要求1所述的SNP標(biāo)記轉(zhuǎn)化為分子標(biāo)記。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的引物對序列為上游引物：SEQ ID NO :2,下游引物：SEQ ID NO :3;所述的分子標(biāo)記序列如SEQ ID NO: 1所示，所述的SNP位點(diǎn) 位于第126位，存在T/C多態(tài)性。4. 按照權(quán)利要求2或3所述的方法得到的分子標(biāo)記。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的分子標(biāo)記，其特征在于，分子標(biāo)記序列如SEQ ID NO : 1所示， 所述的SNP位點(diǎn)位于第126位，存在T/C多態(tài)性。6. -種用于檢測權(quán)利要求1所述的SNP標(biāo)記的引物對，其特征在于，上游引物為：SEQ ID NO :2,下游引物為：SEQ ID NO :3。7. -種檢測權(quán)利要求1所述的SNP標(biāo)記的方法，其特征在于，包含PCR擴(kuò)增中華絨螯蟹 基因組中含有權(quán)利要求1所述的SNP標(biāo)記的一段序列，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，判讀該位點(diǎn)的 T/C多態(tài)性。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 取中華絨螯蟹的腿部肌肉并提取基因組DNA ; (2) 用已提取的中華絨螯蟹基因組DNA為模板，使用權(quán)利要求6所述的引物進(jìn)行PCR擴(kuò) 增； (3) 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用MboII限制性內(nèi)切酶對所得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，分析酶切 結(jié)果，根據(jù)酶切結(jié)果判斷在SEQ ID NO :1第126位的T/C多態(tài)性。9. 權(quán)利要求1所述的SNP標(biāo)記、權(quán)利要求4或5所述的分子標(biāo)記、權(quán)利要求6所述的引 物在選育大規(guī)格中華絨螯蟹新品種中的應(yīng)用。10. -種選育大規(guī)格中華絨螯蟹新品種的方法，其特征在于，包括檢測中華絨螯蟹MIH 基因的372bp處的基因型，選育該核苷酸位點(diǎn)為CC型的個體作為親蟹。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種與中華絨螯蟹體重相關(guān)的SNP標(biāo)志及其應(yīng)用。與中華絨螯蟹體重相關(guān)的SNP標(biāo)記，位于MIH基因的5’-側(cè)翼區(qū)，具體位置為MIH基因的372bp處，堿基變異信息為SNP？g.372T>C，該SNP位點(diǎn)與中華絨螯蟹蟹種的體重性狀之間存在著顯著的相關(guān)性，其中CC基因型個體的平均體重顯著高于TT基因型個體的平均體重。通過對河蟹育種群體進(jìn)行SNP？g.372T>C基因分型，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征分析，可以優(yōu)先選擇基因型為CC的個體作為育種親本，本研究對于選育大規(guī)格河蟹新品種具有重要的指導(dǎo)意義。
【IPC分類】C12N15/11, C12Q1/68
【公開號】CN105002171
【申請?zhí)枴緾N201510461189
【發(fā)明人】許志強(qiáng), 陸全平, 董建昌, 李旭光, 鄧燕飛, 徐宇, 葛家春, 潘建林
【申請人】江蘇省淡水水產(chǎn)研究所, 南京建昌水產(chǎn)養(yǎng)殖專業(yè)合作社
【公開日】2015年10月28日
【申請日】2015年7月30日