一種增強(qiáng)重組乙肝疫苗免疫效應(yīng)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)療實(shí)驗(yàn)領(lǐng)域，具體為一種增強(qiáng)重組乙肝疫苗免疫效應(yīng)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，到現(xiàn)在為止已有數(shù)億人感染乙肝病毒 (h印atitiSBvirus，HBV)或者成為病毒攜帶者，而我國(guó)人群乙肝帶毒率人群高達(dá)10%左 右，而且隨著時(shí)間的推移，這個(gè)數(shù)量也在增加中。而在研究的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中表明：乙型肝炎 病變轉(zhuǎn)為慢性并出現(xiàn)免疫耐受現(xiàn)象與患病機(jī)體的免疫狀態(tài)有關(guān)，而機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答的產(chǎn) 生，在機(jī)體清除乙肝病毒過(guò)程中發(fā)揮重要作用。重組乙肝疫苗可以很好的誘導(dǎo)Thl反應(yīng)，打 破免疫耐受，上調(diào)細(xì)胞免疫功能，但必須增大劑量及多次免疫。因此，尋找有效的免疫佐劑 來(lái)增強(qiáng)疫苗的免疫原性，及提高與保護(hù)性免疫應(yīng)答相關(guān)的免疫細(xì)胞活性具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明所解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種增強(qiáng)重組乙肝疫苗免疫效應(yīng)的方法，以解 決上述【背景技術(shù)】中的缺點(diǎn)。
[0004] 本發(fā)明所解決的技術(shù)問(wèn)題采用以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)： 一種增強(qiáng)重組乙肝疫苗免疫效應(yīng)的方法，其步驟如下， (1) 無(wú)菌條件下取健康人外周血10mL，用肝素抗凝，淋巴細(xì)胞分離液常規(guī)分離PBMC，調(diào) 細(xì)胞濃度為4. 5-5. 5*109/L備用， (2) 通過(guò)常規(guī)的方法培養(yǎng)出五種細(xì)胞，分別是QSG7701細(xì)胞、HepG2細(xì)胞、K562細(xì)胞、 A549細(xì)胞和5-8F細(xì)胞，然后對(duì)每種細(xì)胞的濃度進(jìn)行調(diào)整，取4-5*103個(gè)細(xì)胞/孔加入培養(yǎng) 基板中，以新鮮分離的健康人PBMC細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，在每孔中加入1. 5-2. 0*105個(gè)PBMC，使 其與靶細(xì)胞的比例為50 :1 ; (3) 在上述五種細(xì)胞的另外對(duì)照組中加入正常人體的淋巴細(xì)胞； (4) 在培養(yǎng)基板的每個(gè)孔中加入0DN，使其終濃度為4-5g/mL，效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照孔加入 95-105uL的培養(yǎng)基； (5) 將上述五種細(xì)胞和對(duì)照組置于37°C、5%二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。每孔加 入濃度為4-4. 5mg/mL新鮮配制的無(wú)菌MTT15-25uL，繼續(xù)培養(yǎng)5h，置于2000r/min的離 心培養(yǎng)板上離心IOmin; (6) 收集上清液，通過(guò)全自動(dòng)化分析儀檢測(cè)ALT和LDH的含量，經(jīng)表明加入ODN的細(xì)胞 組的殺傷活性均高于空白對(duì)照組。
[0005] 本發(fā)明的有益效果：經(jīng)ODN活化的PBMC對(duì)HepG2細(xì)胞、K562細(xì)胞、5-8F細(xì)胞和 A549細(xì)胞等細(xì)胞的殺傷活性均明顯高于與相應(yīng)空白對(duì)照組和淋巴細(xì)胞對(duì)照組。
[0006]
【具體實(shí)施方式】
[0007] 為了使本發(fā)明實(shí)現(xiàn)的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達(dá)成目的與功效易于明白了解，下面進(jìn) 一步闡述本發(fā)明。
[0008] -種增強(qiáng)重組乙肝疫苗免疫效應(yīng)的方法，其步驟如下， (1) 無(wú)菌條件下取健康人外周血10mL，用肝素抗凝，淋巴細(xì)胞分離液常規(guī)分離PBMC，調(diào) 細(xì)胞濃度為4. 5-5. 5*109/L備用， (2) 通過(guò)常規(guī)的方法培養(yǎng)出五種細(xì)胞，分別是QSG7701細(xì)胞、HepG2細(xì)胞、K562細(xì)胞、 A549細(xì)胞和5-8F細(xì)胞，然后對(duì)每種細(xì)胞的濃度進(jìn)行調(diào)整，取4-5*103個(gè)細(xì)胞/孔加入培養(yǎng) 基板中，以新鮮分離的健康人PBMC細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，在每孔中加入1. 5-2. 0*105個(gè)PBMC，使 其與靶細(xì)胞的比例為50 :1 ; (3) 在上述五種細(xì)胞的另外對(duì)照組中加入正常人體的PBMC，實(shí)驗(yàn)組一為0DN01，實(shí)驗(yàn)組 二為 0DN02 ; (4) 在培養(yǎng)基板的每個(gè)孔中加入0DN，使其終濃度為4-5g/mL，效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照孔加入 95-105uL的培養(yǎng)基； (5) 將上述五種細(xì)胞和對(duì)照組置于37°C、5%二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。每孔加 入濃度為4-4. 5mg/mL新鮮配制的無(wú)菌MTT15-25uL，繼續(xù)培養(yǎng)5h，置于2000r/min的離 心培養(yǎng)板上離心IOmin; (6) 收集上清液，通過(guò)全自動(dòng)化分析儀檢測(cè)ALT和LDH的含量，經(jīng)表明加入ODN的細(xì)胞 組的殺傷活性均高于空白對(duì)照組。
[0009] 上表為各個(gè)靶細(xì)胞中ALH和LDH的含量表 以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征及本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)，本行業(yè)的技術(shù)人員 應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說(shuō)明書中描述的只是說(shuō)明本發(fā)明 的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和 改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)，本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效 物界定。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種增強(qiáng)重組乙肝疫苗免疫效應(yīng)的方法，其特征是：其步驟如下， (1) 無(wú)菌條件下取健康人外周血10mL，用肝素抗凝，淋巴細(xì)胞分離液常規(guī)分離PBMC，調(diào) 細(xì)胞濃度為4. 5-5. 5*109/L備用， (2) 通過(guò)常規(guī)的方法培養(yǎng)出五種細(xì)胞，分別是QSG7701細(xì)胞、HepG2細(xì)胞、K562細(xì)胞、 A549細(xì)胞和5-8F細(xì)胞，然后對(duì)每種細(xì)胞的濃度進(jìn)行調(diào)整，取4-5*10 3個(gè)細(xì)胞/孔加入培養(yǎng) 基板中，以新鮮分離的健康人PBMC細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，在每孔中加入1. 5-2. 0*105個(gè)PBMC，使 其與靶細(xì)胞的比例為50 :1 ; (3) 在上述五種細(xì)胞的另外對(duì)照組中加入正常人體的淋巴細(xì)胞； (4) 在培養(yǎng)基板的每個(gè)孔中加入0DN，使其終濃度為4-5g / mL，效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照孔加入 95-105uL的培養(yǎng)基； (5) 將上述五種細(xì)胞和對(duì)照組置于37°C、5%二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h ; 每孔加入濃度為4-4. 5mg / mL新鮮配制的無(wú)菌MTT15-25uL，繼續(xù)培養(yǎng)5h，置于 2000r / min的離心培養(yǎng)板上離心10min ; (6) 收集上清液，通過(guò)全自動(dòng)化分析儀檢測(cè)ALT和LDH的含量，經(jīng)表明加入ODN的細(xì)胞 組的殺傷活性均高于空白對(duì)照組。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)一種增強(qiáng)重組乙肝疫苗免疫效應(yīng)的方法，通過(guò)取出QSG7701細(xì)胞、HepG2細(xì)胞、K562細(xì)胞、A549細(xì)胞和5—8F細(xì)胞這五種細(xì)胞分別進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)和ODN活化實(shí)驗(yàn)，然后對(duì)各個(gè)實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行全自動(dòng)化分析儀檢測(cè)ALT和LDH的含量，經(jīng)表明加入ODN的細(xì)胞組的殺傷活性均高于空白對(duì)照組。本發(fā)明證實(shí)經(jīng)ODN、活化的PBMC對(duì)HepG2細(xì)胞、K562細(xì)胞、5—8F細(xì)胞和A549細(xì)胞等細(xì)胞的殺傷活性均明顯高于與相應(yīng)空白對(duì)照組和淋巴細(xì)胞對(duì)照組。
【IPC分類】C12N5/0781, C12Q1/02, C12N5/0786, C12N5/0783
【公開(kāi)號(hào)】CN105002259
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510408996
【發(fā)明人】高峰, 馮輝
【申請(qǐng)人】高峰
【公開(kāi)日】2015年10月28日
【申請(qǐng)日】2015年7月14日