一種檢測(cè)線粒體dna c1494t突變的試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，具體的本發(fā)明提供了一種檢測(cè)線粒體DNAC1494T突變的試劑盒，此外本發(fā)明還提供了該試劑盒在預(yù)測(cè)美尼爾氏病發(fā)病可能性中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]美尼爾氏病，又稱眩暈癥、內(nèi)耳眩暈癥、膜迷路積水，是一種常見(jiàn)病、多發(fā)病。本病癥狀的出現(xiàn)是由內(nèi)耳膜迷路內(nèi)積水膨脹，壓迫內(nèi)耳終器所致。有如下4個(gè)癥狀:眩暈、耳聾、耳鳴及耳內(nèi)悶脹感。其中眩暈多為突然發(fā)作的旋轉(zhuǎn)性眩暈?；颊叱８兄?chē)矬w圍繞自身沿一定的方向旋轉(zhuǎn)，閉目時(shí)癥狀可減輕。常伴惡心、嘔吐、面色蒼白、出冷汗、血壓下降等自主神經(jīng)反射癥狀。頭部的任何運(yùn)動(dòng)都可以使眩暈加重。患者意識(shí)始終清楚，個(gè)別患者即使突然摔倒，也保持著清醒狀態(tài)。眩暈持續(xù)時(shí)間多為數(shù)10分鐘或數(shù)小時(shí)，最長(zhǎng)者不超過(guò)24小時(shí)。眩暈發(fā)作后可轉(zhuǎn)入間歇期，癥狀消失，間歇期長(zhǎng)短因人而異，數(shù)日到數(shù)年不等。眩暈可反復(fù)發(fā)作，同一患者每次發(fā)作的持續(xù)時(shí)間和嚴(yán)重程度不盡相同，不同患者之間亦不相同。且眩暈發(fā)作次數(shù)越多，每次發(fā)作持續(xù)時(shí)間越長(zhǎng)，間歇期越短。
[0003]據(jù)報(bào)道，約20%的美尼爾氏病患者有家族史，該疾病很可能是一種基因與環(huán)境共同作用所致的疾病，目前已研究的致病基因主要包括凝血因子C同源物基因(C0CH)、人白細(xì)胞抗原基因(HLA)、水通道蛋白基因(AQP)和鉀離子通道基因(KCNE)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]發(fā)明人通過(guò)分析大量臨床樣本，發(fā)現(xiàn)線粒體DNA C1494T突變與美尼爾氏病顯著相關(guān)。該發(fā)現(xiàn)提供了一種預(yù)測(cè)美尼爾氏病發(fā)病可能性的新方法，為美尼爾氏病的早期診斷、預(yù)防提供了新的思路。
[0005]—方面，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)線粒體DNA C1494T突變的試劑盒，其包含一對(duì)引物:
引物 1:tacgaaagtggctttaacata，
引物 2:tttgaagtatacttgggaagaD
[0006]另一方面，本發(fā)明提供了該試劑盒在在預(yù)測(cè)美尼爾氏病發(fā)病可能性中的應(yīng)用。
[0007]進(jìn)一步的方法，應(yīng)用包括使用試劑盒中的引物擴(kuò)增待測(cè)對(duì)象基因組DNA樣品后電泳檢測(cè)，如果得到494bp片段，則表明樣品主體有C1494T突變，進(jìn)而有較高的美尼爾氏病發(fā)病可能性。
[0008]再另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了引物對(duì)在制備預(yù)測(cè)美尼爾氏病發(fā)病可能性的試劑盒中的應(yīng)用，其中引物對(duì)序列為:
引物 1:tacgaaagtggctttaacata，
引物 2:tttgaagtatacttgggaagaD
[0009]
【具體實(shí)施方式】
[0010]引物設(shè)計(jì)與合成
使用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 6.0，根據(jù)Genbank中的人線粒體DNA序列設(shè)計(jì)檢測(cè)C1494T突變的引物對(duì):
引物 1:tacgaaagtggctttaacata，
引物 2:tttgaagtatacttgggaagaD
[0011]設(shè)計(jì)的引物對(duì)由上海英駿公司合成。
[0012]具體檢測(cè)過(guò)程樣品處理:
取這待測(cè)者的血濾紙片，將血濾紙片剪碎紙片放入1.5ml Eppendorf管，加入900 μ I紅細(xì)胞裂解緩沖液(20mmol/L Tris-HCl，pH 7.6)室溫靜置lOmin，充分裂解紅細(xì)胞，12000rpm離心lmin，收集白細(xì)胞沉淀；在裝有白細(xì)胞沉淀的1.5mlEP管中加入600 μ I的細(xì)胞裂解液(10mmol/L Tris-Cl、lmmol/L EDTA、0.1% SDS, pH 8.0)和 3μ1 的蛋白酶溶液(20mg/ml蛋白酶K)，充分混勻，55°C恒溫消化裂解2?3h ;待消化液降至室溫，加入200 μ I預(yù)冷5mol/L醋酸鉀溶液，充分混勻，12000rpm_4°C離心15min ;取約700 μ I上清加A600 μ I異丙醇于一新的1.5ml Eppendorf管中，充分混勾，-20°C冰浴30min后，12000rpm離心1min收集DNA沉淀；加入600 μ I乙醇洗滌DNA沉淀，12000rpm離心5min，棄上清，待乙醇揮發(fā)干燥后用高壓滅菌水或TE緩沖液溶解后-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0013]PCR 過(guò)程:
PCR 反應(yīng)體系為 1xPCR 緩沖液 4 μ UdNTP (2.5mM) 2.5 μ UMgCl2 (25mM) 2.5 μ 1、引物 I (5μΜ) 0.5 μ 1、引物 2 (5 4]\00.5“1、丁&1酶(51]/^1) 0.5 μ 1、模板 DNA 50ng、雙蒸水補(bǔ)充至25 μ I。
[0014]PCR反應(yīng)過(guò)程為94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，63°C退火30s，72°C延伸30s，循環(huán)7次；94°C變性30s，55。。退火30s，72。。延伸30s，重復(fù)循環(huán)30次；72°C延伸5min。
[0015]電泳方法為PCR產(chǎn)物10 μ I在2%的瓊脂糖凝膠中電泳，經(jīng)EB染色后在紫外線檢測(cè)儀上觀察并照相記錄結(jié)果。
[0016]結(jié)果判讀方法為如果得到494bp片段，則表明樣品主體有C1494T突變；如果未發(fā)現(xiàn)494bp片段，則表明樣品主體沒(méi)有C1494T突變。
[0017]引物特異性驗(yàn)證
選取下面第4部分中的陰性樣本(無(wú)C1494T突變)10例，陽(yáng)性樣本6例(有C1494T突變)進(jìn)行了線粒體DNA 12S rRNA直接測(cè)序分析，結(jié)果與使用本發(fā)明引物PCR檢測(cè)結(jié)果完全相同，證明了本發(fā)明的引物對(duì)具備良好的特異性和準(zhǔn)確性。
[0018]美尼爾氏病與C1494T突變的關(guān)聯(lián)分析
選取臨床中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)中國(guó)北方美尼爾氏病家系中的9位患者(分布在2代中)和4位非患者，以及100名無(wú)血緣關(guān)系的正常對(duì)照，按照【具體實(shí)施方式】第2部分的方法進(jìn)行檢測(cè)。
[0019]家系中所有9位患者里均發(fā)現(xiàn)了 C1494T突變；家系中4位非患者里I位有C1494T突變，3位無(wú)C1494T突變；100名無(wú)血緣關(guān)系的正常對(duì)照中2位有C1494T突變，98位無(wú)C1494T 突變。
[0020] 結(jié)果初步表明了 C1494T突變與美尼爾氏病之間存在一定關(guān)聯(lián)性。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種檢測(cè)線粒體DNA C1494T突變的試劑盒，其包含一對(duì)引物:引物 1:tacgaaagtggctttaacata，引物 2:tttgaagtatacttgggaagaD2.權(quán)利要求1的試劑盒在預(yù)測(cè)美尼爾氏病發(fā)病可能性中的應(yīng)用。3.權(quán)利要求2的應(yīng)用，該應(yīng)用包括使用試劑盒中的引物擴(kuò)增待測(cè)對(duì)象基因組DNA樣品后電泳檢測(cè)，如果得到494bp片段，則表明樣品主體有C1494T突變，進(jìn)而有較高的美尼爾氏病發(fā)病可能性。4.引物對(duì)在制備預(yù)測(cè)美尼爾氏病發(fā)病可能性的試劑盒中的應(yīng)用，其中引物對(duì)序列為:引物 1:tacgaaagtggctttaacata，引物 2:tttgaagtatacttgggaagaD
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)線粒體DNA？C1494T突變的試劑盒，其包含一對(duì)引物，引物1：tacgaaagtggctttaacata，引物2：tttgaagtatacttgggaaga。此外，本發(fā)明還提供了該試劑盒在預(yù)測(cè)美尼爾氏病發(fā)病可能性中的應(yīng)用。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開(kāi)號(hào)】CN105002289
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510473333
【發(fā)明人】于剛, 菅慧蓉, 陳剛, 李赟, 張?zhí)礻?yáng), 代小燕, 王國(guó)濤
【申請(qǐng)人】于剛
【公開(kāi)日】2015年10月28日
【申請(qǐng)日】2015年8月5日