用于快速鑒定三種斑潛蠅的特異性引物、試劑盒及檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物檢測鑒定技術(shù)，具體地說涉及對3種重要斑潛蠅分子鑒定的特異 性引物及快速分子鑒定方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 斑潛繩屬（Liriomyza)的昆蟲統(tǒng)稱為斑潛繩，隸屬于雙翅目（Diptera)，潛繩科 (Agromyzidae)，植潛繩亞科（Phtomyzinae)。目前全世界已知斑潛繩300種，并均為植 食性害蟲（Spence，1973 ;陳小琳和汪興鑒，2000 ;陳文龍等，2007)。在已知的斑潛蠅種類 中，許多種類均為重要的農(nóng)業(yè)害蟲，對農(nóng)作物造成嚴(yán)重危害，在許多國家被列為檢疫性害蟲 (Spence, 1989 ;康樂，1996)。根據(jù)國內(nèi)外文獻(xiàn)記載和各地的普查統(tǒng)計，目前我國記錄斑潛 蠅19種（陳小琳和汪興鑒，2000 ;陳文龍等，2007)，其中發(fā)生最為嚴(yán)重有3種，即美洲斑潛 繩（Liriomyzasativae)、三葉斑潛繩（L.trifolii)、南美斑潛繩（L.huidobrensis)，它們 均為外來有害生物，也是我國進(jìn)境檢疫性害蟲。近年來，隨著設(shè)施栽培的發(fā)展，蔬菜斑潛蠅 的發(fā)生與危害程度日趨嚴(yán)重。因此，準(zhǔn)確地利用分子生物學(xué)技術(shù)對這3種斑潛蠅進(jìn)行快速 而準(zhǔn)確鑒定，對生產(chǎn)上指導(dǎo)這些害蟲的防治具有重要意義；同時也可為檢疫部門進(jìn)行快速 通關(guān)的檢驗檢疫提供技術(shù)支撐。
[0003] 由于上述3種重要斑潛蠅的外部形態(tài)相似，生態(tài)位重疊嚴(yán)重，其鑒定容易混淆，常 給檢疫、測報和防治等工作帶來困難，同時由于在田間采集的斑潛蠅大多為潛食在葉片中 的幼蟲，想要經(jīng)濟(jì)方便的鑒定其種類必須等到成蟲羽化后通過形態(tài)學(xué)特征加以鑒定費時費 力。因此開發(fā)者3種重要斑潛蠅的快速鑒定技術(shù)顯得極為重要。目前國內(nèi)外對其鑒定識別 大多為形態(tài)學(xué)上的，分子鑒定方法的研究也多為通過傳統(tǒng)的分子檢測方法，利用DNA測序 技術(shù)雖然能夠準(zhǔn)確鑒定，但一方面測序成本比較高，另一方面測序過程所需時間周期比較 長，達(dá)不到快速的要求。因此目前需要盡快建立一套快速靈敏的鑒定檢測方法，以便對這三 種斑潛蠅作出準(zhǔn)確、快速的鑒定，從而確保對外貿(mào)易的正常發(fā)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明目的是提供一套用于快速鑒定三種重要斑潛蠅種類的特異性引物，它能滿 足現(xiàn)有技術(shù)的上述需求。
[0005] 用于快速鑒定三種重要斑潛蠅種類的特異性引物組，由4條引物組成，引物序列 如SEQIDNO. 1、SEQIDNO. 2、SEQIDNO. 3 和SEQIDNO. 4 所示。
[0006] -種對于3種重要斑潛蠅的分子鑒定方法，用上述的4條特異性引物對待測樣品 進(jìn)行PCR擴增，根據(jù)擴增產(chǎn)物的大小鑒定出三葉斑潛蠅，美洲斑潛蠅，南美斑潛蠅，其擴增 片段的大小分別為705bp、1055bp和358bp。
[0007] 本發(fā)明還公開了三種重要斑潛蠅線粒體COI基因序列擴增方法，是采用上述的引 物，用25 y I PCR體系在特定PCR擴增條件下進(jìn)行目標(biāo)片段擴增。
[0008] 所述的 25yIPCR體系是：5yI10Xbuffer(+Mg2+)，IyIdNTP(2. 5mM)，Iy1 弓I 物（IOyM)共4yl，0.5ylrTaq酶（5y/yl)，2ylDNA模板（100ng)，12.5yl雙蒸水。
[0009] 所述的PCR擴增條件是：94°C預(yù)變性3分鐘，94°C變性1分鐘，58°C(Tm)退火1分 鐘，72 °C延伸1分鐘，共35個循環(huán)，最后72 °C延伸10分鐘。
[0010] 本實驗從分子水平依據(jù)三種斑潛蠅線粒體COI基因設(shè)計出四條引物，利用這四條 引物，在利用多重PCR技術(shù)進(jìn)行擴增，結(jié)果顯示這四條引物的擴增結(jié)果能夠有效快速地區(qū) 分出三種斑潛蠅。同時每種斑潛蠅都設(shè)置了 4個重復(fù)，結(jié)果顯示該套引物對于不同的斑潛 蠅以及同種斑潛蠅的3個重復(fù)均體現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性，保證了鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性，說明該 套引物具有較高的靈敏度。
[0011] 另外，可以將本發(fā)明引物以及相關(guān)試劑組裝成試劑盒，以方便使用。一種斑潛蠅 PCR鑒定用試劑盒，包括PCR試劑和上述特異性引物組。本發(fā)明的試劑盒可以是由多個隔 斷所形成，以容納固定一個或多個如管或小瓶的容器。這些容器之一或者多個可以裝有本 發(fā)明的引物，根據(jù)需要該引物可以是凍干形式或溶于緩沖液中的狀態(tài)。另外，本發(fā)明的試劑 盒中還可以包括用于PCR反應(yīng)的一種或多種酶/試劑，以及實施本發(fā)明所需要的其它成分 及用具。該試劑盒能夠同時快速準(zhǔn)確地鑒別出三葉斑潛蠅，美洲斑潛蠅，南美斑潛蠅，三種 斑潛蠅，同時該試劑盒檢測方法無需對反應(yīng)體系及反應(yīng)程序進(jìn)行調(diào)整，而且整個檢測過程 (包括PCR反應(yīng)和電泳檢測）耗時不到3小時，大大縮短了檢測時間。本試劑盒的缺點是必 須確定待測樣品屬于三葉斑潛蠅，美洲斑潛蠅，南美斑潛蠅才能適用，一旦超出這三種斑潛 蠅范圍，該試劑盒不再適用，但可以根據(jù)需要重新設(shè)計一對或多對上游引物，利用其擴增結(jié) 果及其組合，在原來試劑盒的基礎(chǔ)上重新修改構(gòu)成一個新的試劑盒，因此，利用該種方法構(gòu) 建的試劑盒可控性很好，可以隨時根據(jù)檢疫對象而擴大試劑盒的檢測范圍。能顯著降低實 驗成本，縮短實驗周期，提高實驗的準(zhǔn)確性。
【附圖說明】
[0012] 圖1是本發(fā)明引物組對擴增三種斑潛蠅成蟲電泳檢測圖譜。
[0013] 其中，泳道1-3號為三葉斑潛蠅，4-6號為美洲斑潛蠅，7-9號為南美斑潛蠅M為 MarkerDL2000〇
[0014] 圖2是本發(fā)明引物組對擴增三葉斑潛蠅各蟲態(tài)的電泳檢測圖譜。
[0015] 其中，泳道1-3號為三葉斑潛蠅幼蟲，4-6號為三葉斑潛蠅蛹，7-9號為三葉斑潛蠅 成蟲M為MarkerDL2000。
【具體實施方式】
[0016] 1?引物設(shè)計
[0017] 下載GenBank中已測的3種斑潛蠅的mtDNACOI基因序列的登記號分別為：三葉 斑潛繩（Liriomyzatrifolii，EU219614)，美洲斑潛繩（Liriomyzasativae，AY375175)，南 美斑潛繩（Liriomyzahuidobrensis，EU219615)。根據(jù)引物設(shè)計原則及注意事項，盡量在特 異性區(qū)域進(jìn)行引物的設(shè)計，使用PrimerPremier5.0和Oligo6. 71引物設(shè)計軟件在3種斑 潛蠅的mtDNACOI基因范圍內(nèi)自動搜索出合適的引物，用Oligo6. 71軟件對每條引物進(jìn)行 評價和修改，以避免存在引物內(nèi)或引物間二聚體以及引物錯配位點的出現(xiàn)等，最終設(shè)計出3 種斑潛蠅的4條引物（表1)。
[0018] 表1.本研究設(shè)計的4條特異性引物序列
[0019]
[0020] 2.斑潛蠅基因組DNA的提取
[0021] 本實驗采用Axygen公司的AxyPrep基因組DNA小量試劑盒提取3種斑潛繩基因 組DNA。該方法操作簡單、快速、高效且無毒，提取的DNA的質(zhì)量符合本研究的需要，具體操 作步驟如下：
[0022] 1)用鑷子挑取浸漬在100%乙醇中的單頭斑潛蠅，用雙蒸水充分洗滌兩次后置于 I. 5mL離心管中；
[0023] 2)加入 175yLBufferPBS和 0? 45yLRNaseA,溫和研磨 30s;
[0024] 3)分別加入 75yLBufferC-L和 10yLProteinaseK，立即游禍振蕩Imin混合 均勻。短暫離心后將離心管置于56°C水浴IOmin;
[0025] 4)在水浴后產(chǎn)物中加入175yLBufferP-D，漩渦振蕩30s混合均勻，12000rpm離 心IOmin;
[0026] 5)將DNA制備管置于2mL離心管中，將上述產(chǎn)物上清液移至制備管中，12000rpm 離心Imin;
[0027] 6)棄濾液，將制備管置回原來的2mL離心管中，加入250yLBufferWl，12000rpm 離心Imin;
[0028] 7)棄濾液，將制備管置回原來的2mL離心管中，加入350yLBufferW2，12000rpm 離心Imin;
[0029] 8)以同樣的方法，用350yLBufferW2再洗滌一次；
[0030] 9)棄濾液，將制備管置回原來的2mL離心管中，12000rpm離心Imin;
[0031] 10)將DNA制備管置于另一潔凈的1.5mL離心管中，在制備管摸中央加40yL Eluent，室溫靜置lmin，12000rpm離心Imin洗脫DNA;
[0032] 11)獲得的基因組DNA保存在-20°C冰箱中備用。
[0033] 3.PCR產(chǎn)物擴增
[0034] 表2.本發(fā)明中25yIPCR反應(yīng)體系
[0035]
[0036] 本發(fā)明中25yIPCR反應(yīng)體系如表2,PCR反應(yīng)程序為：94°C預(yù)變性3分鐘，94°C變 性1分鐘，58°C(Tm)退火1分鐘，72 °C延伸1分鐘，共35個循環(huán)，最后72 °C延伸10分鐘。
[0037] 4. PCR產(chǎn)物的電泳檢測
[0038] 取5 y L PCR產(chǎn)物，加I y L左右上樣緩沖液，混合均勻。加樣于0. 5 X TBE緩沖液 配制的1 %瓊脂糖凝膠孔中，點樣后，120V恒壓條件下電泳，至溴酚蘭接近膠板前緣，停止 電泳。將凝膠置于紫外透射儀中或凝膠成像系統(tǒng)中觀察，記錄結(jié)果并拍照。
[0039] 5?實驗結(jié)果
[0040] 根據(jù)以上4條引物擴增的結(jié)果，通過擴增出的產(chǎn)物的大小可以得出這樣的結(jié)論： 本發(fā)明引物組對三葉斑潛蠅擴增片段為705bp(圖1，泳道1-3)，美洲斑潛蠅擴增片段為 1055bp(圖1，泳道4-6)，南美斑潛蠅擴增片段為358bp(圖1，泳道7-9);同時對三葉斑潛 蠅各蟲態(tài)的擴增穩(wěn)定（圖2)。
[0041] 6.試劑盒的研制
[0042] 在利用斑潛蠅線粒體COI基因進(jìn)行快速檢測時，四條引物對于我們來說是已知 的，而具體哪種斑潛蠅是未知的，對于同一頭斑潛蠅我們用4條引物同時進(jìn)行多重PCR擴 增，可以按照各引物的擴增結(jié)果進(jìn)行快速鑒定，三葉斑潛蠅擴增片段為705bp，美洲斑潛蠅 擴增片段為l〇55bp，南美斑潛蠅擴增片段為358bp，從而判斷出具體的斑潛蠅種類，形成一 個快速有效的試劑盒，為檢疫部門提供一套快速靈敏的鑒定檢測方法。
【主權(quán)項】
1. 用于快速鑒定3種重要斑潛蠅種類的特異性引物組，其特征在于，由4條引物組成， 引物序列如 SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3 和 SEQ ID NO. 4 所示。2. -種斑潛蠅PCR鑒定用試劑盒，包括PCR試劑和特異性引物，其特征在于，所述特異 性引物是由4條引物組成的引物組，其序列如SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3和 SEQ ID NO. 4 所示。3. -種用于3種重要斑潛蠅的分子鑒定方法，其特征在于，用權(quán)利要求1所述的4條特 異性引物對待測樣品進(jìn)行PCR擴增，根據(jù)擴增產(chǎn)物的大小鑒定出三葉斑潛蠅，美洲斑潛蠅， 南美斑潛蠅，其中三葉斑潛蠅的擴增片段為705bp，美洲斑潛蠅的擴增片段為1055bp，南美 斑潛蠅的擴增片段為358bp。
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于快速鑒定3種入侵斑潛蠅的特異性引物、試劑盒及檢測方法，所述的特異性引物序列如SEQ？ID？NO.1、SEQ？ID？NO.2、SEQ？ID？NO.3和SEQ？ID？NO.4所示。采用本發(fā)明的擴增引物，能準(zhǔn)確而快速地鑒別3種入侵斑潛蠅，該方法操作簡便快捷，具有廣泛的適用性。本發(fā)明為3種斑潛蠅的快速鑒定及檢疫檢驗提供了重要的技術(shù)支撐，具有重要的實用價值。
【IPC分類】C12N15/11, C12Q1/68
【公開號】CN105002296
【申請?zhí)枴緾N201510525069
【發(fā)明人】杜予州, 常亞文, 王靜靜, 陸明星, 龔偉榮
【申請人】揚州大學(xué)
【公開日】2015年10月28日
【申請日】2015年8月24日