Toll-like受體5抑制多肽及其應用
【技術(shù)領域】：
[0001] 本發(fā)明涉及藥物領域，具體涉及用于預防和治療或預防類風濕性關(guān)節(jié)炎的 Toll-Iike受體5抑制多肽。
【背景技術(shù)】：
[0002] Toll樣受體（Toll-like rec印tors，TLR)是參與非特異性免疫（天然免疫）的一 類重要蛋白質(zhì)分子，也是連接非特異性免疫和特異性免疫的橋梁。從結(jié)構(gòu)來看，TLR屬于N 型跨膜蛋白，包括富含亮氨酸重復序列的膜外區(qū)（識別PAMP)、跨膜區(qū)和含有TIR結(jié)構(gòu)域的 胞漿區(qū)（介導下游信號傳遞）。依據(jù)其細胞定位，TLR主要分為兩類：一類包括TLRUTLR2、 TLR4、TLR5、TLR6和TLRl 1，位于細胞表面，配體為微生物的膜結(jié)構(gòu)如蛋白、脂類、脂蛋白等， 可以被小分子或抗體激活；另一類包含TLR3、TLR7、TLR8和TLR9,位于胞內(nèi)囊泡結(jié)構(gòu)（溶酶 體、內(nèi)涵體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等），識別微生物的核酸。TLR能夠啟動和傳導與感染、炎癥和天然免疫 相關(guān)的多條細胞信號通路，是這類疾病防治和藥物開發(fā)的重要靶點。
[0003] 目前，以TLR為靶點的藥物，包括TLR激動劑和TLR抑制劑。TLR激動劑用于抗腫 瘤、抗病毒及細菌感染，以及抗過敏、哮喘等疾??；TLR拮抗劑屬于免疫抑制劑，可用于治療 免疫系統(tǒng)異?；罨募膊?，如敗血癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE)、類風濕關(guān)節(jié)炎（RA)等。TLR9 詰抗劑hydroxychloroquine (HCQ)目前是治療SLE和RA的藥物之一，同時它也能詰抗TLR7 和TLR8。復合抑制劑CPG-52364拮抗TLR7、TLR8及TLR9,可以抑制SLE等天然免疫疾病 (動物實驗），目前正在進行一期臨床實驗。同類藥物IRS-954、頂0-3100等也在研究中。
[0004] TLR5主要在腸上皮細胞、單核細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞的表面表達，已有的 TLR5激動劑多肽藥物CBLB502(克隆自Salmonella enterica)，在放射損傷小鼠模型中，對 造血系統(tǒng)及胃腸道系統(tǒng)均表現(xiàn)出較顯著的保護作用，延長高劑量照射后小鼠的生存時間， 提高低劑量照射小鼠的生存率。其主要機制是激動NF- κ B，抑制p53信號通路，是一種放射 損傷保護藥。由于TLR5激動劑能活化NF-κ B蛋白，而NF-κ B蛋白與類風濕關(guān)節(jié)炎中炎 癥的發(fā)生，軟骨損傷，細胞迀移以及血管翳的形成都有重要的關(guān)系。因此，TLR5拮抗劑成為 治療類風濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA)的新祀點。盡管如此，并沒有成熟開發(fā)的 Toll-Iike受體5抑制多肽問世，用于治療RA。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005] 本發(fā)明目的是針對TLR5靶向藥物的特點，設計一種Toll-Iike受體5多肽拮抗 劑，可以用于治療或預防類風濕性關(guān)節(jié)炎。
[0006] 本發(fā)明技術(shù)方案是提供一種Toll-Iike受體5抑制多肽，其序列為 QKAWGAARRVSKDDW，及在治療或預防類風濕性關(guān)節(jié)炎藥物中的應用?？赏ㄟ^多種給藥方式治 療和預防類風濕關(guān)節(jié)炎疾病，包括皮下或肌肉注射，靜脈注射或者靜脈滴注，口服給藥如藥 丸、膠囊等，鼻噴劑等。
[0007] 有益結(jié)果：
[0008] 本發(fā)明中的Toll-like受體5抑制多肽序列QKAWGAARRVSKDDW，可以靶向抑制 Toll-Iike受體5,抑制Toll-Iike受體5受體產(chǎn)生的生理或病理的效應，達到預防或治療 類風濕性關(guān)節(jié)炎的效果。
[0009] 發(fā)明人經(jīng)過大量實驗獲知Toll-Iike受體5抑制多肽能夠抑制佐劑型大鼠類風濕 關(guān)節(jié)炎和DBA/1小鼠膠原型類風濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)展，體內(nèi)實驗證明具有顯著的治療類風濕 型關(guān)節(jié)炎的效果。說明本發(fā)明設計的Toll-Iike受體5抑制多肽科學、合理、可行有效，能 作為治療或預防類風濕性關(guān)節(jié)炎藥物。
【具體實施方式】
[0010] 實施例1
[0011] Toll-Iike受體5抑制多肽在膠原誘導小鼠關(guān)節(jié)炎動物模型體內(nèi)免疫保護作用
[0012] 構(gòu)建膠原型小鼠關(guān)節(jié)炎動物模型，研究Toll-Iike受體5抑制多肽對小鼠膠原誘 導性關(guān)節(jié)炎（collagen induced arthritis，CIA)的治療作用。采用小鼠作為受試動物， SPF級DBA/1小鼠60只（由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司（Sino-British SIPPR Lab. Animal Ltd)提供，動物生產(chǎn)許可證號碼：SCXK (滬）2008-0016)，雄性，7-8周齡，體重 為18-22g，隨機分成6組，分別是正常對照組，模型對照組，多肽低中高3個劑量組（1. 5， 3,6mg/kg)和陽性藥對照組（甲氨蝶呤2mg/kg)。除正常組外，第0天各實驗組建立小鼠 CIA模型，方法是雞軟骨II型膠原（c II )用0. lmol/1醋酸溶解成4mg/ml的溶液，于4°C冰 箱過夜。實驗當天用 II 型膠原與含 4mg/ml Myeobaeterium tuberculosis strain H37Rv 的完全弗氏佐劑（CFA)等體積充分乳化，待DBA/1小鼠麻醉后，于其尾部皮內(nèi)每只注射乳化 劑50 μ 1進行致敏，21d后用4mg/ml的II型膠原（c II )與不完全弗氏佐劑（IFA)等體積充 分乳化后以相同劑量的乳化劑于尾部進行再次免疫。造模第30d起皮下注射給藥：多肽的 3個劑量組（1.5,3,6mg/kg):每日兩次，連續(xù)7天；陽性藥對照組（甲氨蝶呤2mg/kg):每3 天一次，連續(xù)3次；正常對照組和模型對照組（生理鹽水）：連續(xù)7天。分別于造模后第38 天測關(guān)節(jié)評分、分別檢測左右后足足踝直徑來觀察藥物對小鼠膠原型關(guān)節(jié)炎的影響。
[0013] Toll-Iike受體5抑制多肽在膠原誘導小鼠關(guān)節(jié)炎動物模型體內(nèi)免疫保護作用 具體結(jié)果如下=Toll-Iike受體5抑制多肽對小鼠膠原型關(guān)節(jié)腫脹度的影響，陽性對照組、 Toll-Iike受體5抑制多肽高、中、低劑量組關(guān)節(jié)腫脹度與模型組比較，均有極顯著性差異 (P〈0. 01)實驗結(jié)果具有統(tǒng)計學意義。Toll-Iike受體5抑制多肽對小鼠膠原型關(guān)節(jié)炎足爪 腫脹度的影響，陽性對照組、Toll-Iike受體5抑制多肽高、中、低劑量組足爪腫脹度與模型 組比較，均有極顯著性差異（P〈〇. 01)，實驗結(jié)果具有統(tǒng)計學意義。多肽對膠原型關(guān)節(jié)炎小鼠 關(guān)節(jié)評分的影響，多肽低、中、高劑量組四肢評分顯著低于模型對照組（P < 〇. 01)，與模型 對照組比較極顯著性差異，實驗結(jié)果具有統(tǒng)計學意義。
[0014] 表1 Toll-Iike受體5抑制多肽對膠原型關(guān)節(jié)炎的影響（means土SD)
[0015]
[0017] *Ρ〈0· 05 ;#Ρ〈0· 01 (和模型組比較）
[0018] 結(jié)論：Toll-like受體5抑制多肽對小鼠膠原型關(guān)節(jié)炎具有治療作用。
[0019] 實施例2
[0020] Toll-Iike受體5抑制多肽對佐劑型大鼠關(guān)節(jié)炎動物模型體內(nèi)免疫保護作用 [0021 ] 構(gòu)建佐劑型大鼠關(guān)節(jié)炎動物模型，研究多肽對佐劑性關(guān)節(jié)炎（Ad juvant arthritis，AA)大鼠的治療作用。采用大鼠作為受試動物，SPF級SD大鼠60只（由上海西 普爾-必凱實驗動物有限公司（Sino-British SIPPR Lab. Animal Ltd)提供，動物生產(chǎn)許 可證號碼：SCXK (滬）2008-0016)，雄性，體重為140g-160g，隨機分成6組，分別是正常對照 組，模型對照組，Toll-Iike受體5抑制多肽低中高3個劑量組（0. 75,1. 5, 3mg/kg)和陽性 藥對照組（甲氨蝶呤lmg/kg)。除正常組外，第0天各實驗組建立大鼠 AA模型，方法是在 大鼠的左側(cè)后足足跎注射含滅活的結(jié)核分枝桿菌（H37RA，10mg/ml)完全弗氏佐劑0.1 ml造 成大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎模型。造模第10天起皮下注射給藥：多肽的3個劑量組（0. 75,1. 5， 3mg/kg):每日兩次，連續(xù)7天；陽性藥對照組（甲氨蝶呤lmg/kg):每3天一次，連續(xù)3次； 正常對照組和模型對照組（生理鹽水）：連續(xù)7天。造模后第18天，關(guān)節(jié)評分、分別檢測左 右后足足踝直徑來觀察藥物對大鼠佐劑型關(guān)節(jié)炎的影響。
[0022] 多肽在佐劑性大鼠關(guān)節(jié)炎動物模型體內(nèi)免疫保護作用，具體結(jié)果如下：Toll-Iike 受體5抑制多肽對大鼠原發(fā)性關(guān)節(jié)炎足爪腫脹度的影響，大鼠陽性對照組、Toll-Iike受 體5抑制多肽的低、中、高劑量組左后足踝直徑與模型組比較，有極顯著性差異（P〈0.01); Toll-like受體5抑制多肽對大鼠繼發(fā)性關(guān)節(jié)炎右后足踝直徑的影響，大鼠陽性對照組、 Toll-Iike受體5抑制多肽低、中、高劑量組右后足踝直徑與模型組比較，有顯著性差異 (P〈0. 05)。Toll-Iike受體5抑制多肽對佐劑型關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)評分的影響，多肽低、中、 高劑量組四肢評分顯著低于模型對照組（P < 0. 05)，與模型對照組比較差異均有統(tǒng)計學意 義。
[0023] 表2 Toll-Iike受體5抑制多肽對佐劑型關(guān)節(jié)炎的影響（means土SD)
[0025] · *Ρ〈0· 〇5 ;林P〈0. 01 (和模型組比較）
[0026] 結(jié)論：Tol 1-1 ike受體5抑制多肽對AA大鼠關(guān)節(jié)炎具有治療作用。
【主權(quán)項】
1. Toll-like受體5抑制多肽，其特征在于其序列為QKAWGAARRVSKDDW。2. 權(quán)利要求1的抑制多肽在制備治療和預防類風濕關(guān)節(jié)炎疾病藥物中的應用。3. 根據(jù)權(quán)利要求1-2任一所述抑制多肽的用途，其特征在于：可通過多種給藥方式治 療和預防類風濕關(guān)節(jié)炎疾病，包括皮下或肌肉注射，靜脈注射或者靜脈滴注，口服給藥如藥 丸、膠囊等，鼻噴劑等。
【專利摘要】本發(fā)明涉及藥物領域，具體涉及具有抑制Toll-like受體5，其序列為QKAWGAARRVSKDDW，是全新的序列，能預防和治療類風濕性關(guān)節(jié)炎。該多肽可通過多種給藥方式治療和預防類風濕關(guān)節(jié)炎疾病，包括皮下或肌肉注射，靜脈注射或者靜脈滴注，口服給藥如藥丸、膠囊等，鼻噴劑等。本發(fā)明的有益效益是可用于治療類風濕性關(guān)節(jié)炎，具有潛在的新藥開發(fā)價值。
【IPC分類】A61K38/10, A61P29/00, A61P19/02, C07K7/08
【公開號】CN105017389
【申請?zhí)枴緾N201510547671
【發(fā)明人】羅瑞雪
【申請人】蘇州普羅達生物科技有限公司
【公開日】2015年11月4日
【申請日】2015年8月31日