[0028] 地衣芽胞桿菌B-3菌株的發(fā)酵培養(yǎng)的條件為180rpm，37°C，12h。
[0029] 2.分子生物學(xué)特征：16SrDNA基因序列測定 對地衣芽胞桿菌B-3細(xì)胞進行DNA提取，對菌株的16SrDNA片段進行PCR并測序，在 NCBI上進行比對，確定各菌株種類。
[0030] PCR體系具體如表1: 表1 PCR 體系（50 μ L):
表 1中，F(xiàn)orward primer (PA)序列為：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG。Reverse primer (PB) 序列為：AAGGAGGTGATCCAGCCGCA。
[0031] PCR擴增條件： 1. 94°C 5min 2. 95〇C Imin 3. 56 °C Imin 4. 72 °C 2min 5. 循環(huán)24步驟33次 6. 72〇C IOmin 7. 16°C 恒溫。
[0032] WSrDNA 測序結(jié)果：

[0033] 3.地衣芽胞桿菌B-3菌株Meg5. 1建樹 對地衣芽胞桿菌B-3菌株的16S rDNA序列圖譜校正，提交GenBank，并在GenBank， EMBL，DDBJ等國際核酸序列數(shù)據(jù)庫中進行同源序列搜索（BLASTsearch)，比較測試菌株與 模式菌株對應(yīng)序列的相似程度，并結(jié)合形態(tài)學(xué)及生理學(xué)特征分析對其做出鑒定。
[0034] 菌株間的序列比較用Clustal. X軟件完成。用Neighbor-Joining方法進行分子 系統(tǒng)學(xué)分析，并進行1000次bootstrap統(tǒng)計學(xué)檢驗，用TreeView軟件顯示系統(tǒng)樹，見圖3〇
[0035] 4.發(fā)酵菌劑制備 取地衣芽胞桿菌B-3菌種，在無菌條件下(超凈工作臺），用滅菌竹簽挑取少許菌種，轉(zhuǎn) 接于已滅菌的固體LB培養(yǎng)基試管（15X 150mm)中，置培養(yǎng)箱內(nèi)38°C活化培養(yǎng)1~2天。
[0036] 取出活化1~2天的斜面菌種，在無菌條件下，以同樣方式接入菌種到已滅菌的種 子液體培養(yǎng)基中，在35°C，轉(zhuǎn)速180rpm下?lián)u床培養(yǎng)1~2天，即為地衣芽胞桿菌B-3菌株發(fā) 酵種子菌液。如圖1所示。
[0037] 發(fā)酵采用250ml玻璃三角瓶，裝入種子液體培養(yǎng)基100ml，121°C滅菌30min后，取 出冷卻后放置35°C培養(yǎng)箱過夜，無雜菌污染即可確認(rèn)滅菌徹底，可用于后續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)。
[0038] 在無菌條件下，取地衣芽胞桿菌B-3種子液，接種于裝有100mL發(fā)酵液體培養(yǎng)基的 250ml玻璃三角瓶中，接種量為5~15%(v/w)，置35°C通氣培養(yǎng)2~3天。在發(fā)酵期間，注 意發(fā)酵室溫度變化，檢查有無染菌現(xiàn)象。
[0039] 發(fā)酵完畢，收集發(fā)酵液，以8000r/min~11000r/min，離心5min~15min，棄 上清液得到濕菌體，或進一步將濕菌體制備成粉劑或凍干粉，保藏于4°C冰箱備用。將保存 的濕菌劑用稀釋液按1 :1〇〇稀釋，稀釋好的菌液濃度為IO9 cfu/mL，對烤煙煙葉噴灑。
[0040] 上述用于防治倉儲陳化煙葉霉變的發(fā)酵工藝應(yīng)用工藝步驟是：用5mL稀釋液將濕 菌體重懸后，獲得濃度為IO9 cfu/mL的菌液，均勻噴灑到50g煙葉上，以等量無菌去離子水 為對照。
[0041] 將噴好的煙葉置于28°C~45°C，相對濕度30%~90%條件下儲藏陳化36h~ 480h，煙葉儲藏陳化溫度范圍為：28°C~45°C，相對濕度范圍為30%~90%，儲藏陳化時 間為48~480h，36h后每天觀察煙葉變化，記錄煙葉霉變情況，確定生防菌株對煙葉霉變的 防效。
[0042] 具體步驟如下： 取保藏號為CCTCC NO :M201499的地衣芽孢桿菌（你 CiWiAS )B-3菌 株的發(fā)酵液離心，收集菌體棄上清，取濕菌體，用稀釋液將其稀釋至IO9 cfu/mL制備成菌 液，采用無菌去離子水作對照。
[0043] 將制備好的地衣芽孢桿菌B-3的菌液按8%比重均勻噴灑到煙葉上，煙葉樣品為云 南玉溪煙廠打葉復(fù)烤好準(zhǔn)備入庫倉儲陳化的K326中部煙葉，將處理好的煙葉放置于人工 氣候箱，氣候箱溫度35°C，濕度80%，在人工氣候箱儲藏陳化20天。
[0044] 36h后開始每天觀察煙葉變化，記錄煙葉霉變情況，確定生防菌株對煙葉霉變的防 效。
[0045]
[0046] 地衣芽孢桿菌B-3菌劑對抑制煙葉霉變效果很明顯。加入地衣芽孢桿菌B-3菌劑 的煙葉到第17天出現(xiàn)霉菌白色菌絲，之前16天未觀察到霉菌菌絲。而對照CK (清水）卻 在第5天就出現(xiàn)霉菌菌絲了，第11天煙葉上布滿了霉菌菌絲及一些孢子。
[0047] 同時，加入B-3菌劑的比沒有加的對照CK (清水）的陳化煙葉顏色變深的速度慢。 地衣芽孢桿菌B-3菌劑能夠較好的抑制倉儲煙葉霉變，提高煙葉品質(zhì)。
[0048] 本發(fā)明得到的防治倉儲陳化煙葉霉?fàn)€的高溫菌地衣芽孢桿菌B-3,具有易培養(yǎng)，發(fā) 酵速度快，防治效果好，是一株新的防治陳化煙葉霉變的高溫菌菌株。煙葉經(jīng)該微生物處理 后，防治陳化煙葉霉變效果明顯。
【主權(quán)項】
1. 一種用于防治倉儲煙草霉變的地衣芽孢桿菌，其特征在于，其所述的地衣芽孢桿 (萬aciWys )B-3,其已在保藏單位CCTCC保藏，保藏編號為CCTCC NO:M 2014499。2. 如權(quán)利要求1所述用于防治倉儲煙草霉變的地衣芽孢桿菌，其特征在于：培養(yǎng)地衣 芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基為：煙葉粉末I g/L，酵母粉3 g/L，蛋白胨5 g/L，NaCl 3 g/L，pH為 自然，培養(yǎng)條件為180rpm，37°C下培養(yǎng)12小時。3. 權(quán)利要求1所述的地衣芽孢桿菌防治倉儲煙草霉變的應(yīng)用，其特征在于：所述地衣 mWMUieicilluslicheniformis1一株高溫菌，應(yīng)用于防治倉儲煙草霉變，提高 倉儲煙葉品質(zhì)。4. 如權(quán)利要求3所述的地衣芽孢桿菌防治倉儲煙草霉變的應(yīng)用，其特征在于：所述地 衣芽孢桿菌B-3制備成細(xì)胞濃度為10scfu/mL~IO 11 cfu/mL菌液，pH為自然，按5-15%質(zhì) 量比加入稀釋液中，混合后對烘烤煙葉噴灑，用于防治倉儲煙草霉變。5. 如權(quán)利要求4所述的地衣芽孢桿菌防治倉儲煙草霉變的應(yīng)用，其特征在于：所述的 稀釋液為煙葉粉末I. 5 g/L和水混合組成。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高溫細(xì)菌地衣芽孢桿菌及其防治煙葉霉變應(yīng)用。本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)領(lǐng)域，也涉及防治倉儲陳化煙葉霉變的技術(shù)領(lǐng)域。所述的防治煙葉霉變菌株命名為地衣芽孢桿菌（Bacillus？？licheniformis）B-3，已在保藏單位保藏，保藏單位名稱：中國典型培養(yǎng)物保藏中心，簡稱CCTCC，保藏日期為2014年10月20日，保藏編號為CCTCC？NO：M？2014499。本發(fā)明的地衣芽孢桿菌B-3是一種分離于玉溪煙廠陳化煙葉的高溫細(xì)菌，防治倉儲煙葉霉變效果顯著，具有對人、畜安全，環(huán)境友好，提高倉儲煙葉品質(zhì)等優(yōu)點。CCTCC NO: M201449920141020
【IPC分類】A01N63/00, A01P3/00, C12N1/20, C12R1/10
【公開號】CN105018369
【申請?zhí)枴緾N201510025323
【發(fā)明人】賴泳紅, 崔曉龍, 王永霞, 肖煒, 張家偉, 李治瀅, 王曉峰
【申請人】云南大學(xué)
【公開日】2015年11月4日
【申請日】2015年1月19日