一種光合菌粉劑的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一種微生物制劑，特別涉及一種光合菌凍干粉劑的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 光合細(xì)菌是地球上出現(xiàn)最早、自然界中普遍存在、具有原始光能合成體系的原核 生物，是在厭氧條件下進(jìn)行不放氧光合作用的細(xì)菌的總稱。光合細(xì)菌是一類沒有形成芽孢 能力的革蘭氏陰性菌，它們以光作為能源、能在厭氧光照或好氧黑暗條件下利用自然界中 的有機(jī)物、硫化物、氨等作為供氫體兼碳源進(jìn)行光合作用的微生物；具有固氮、固碳、脫硫等 作用。其生命力強(qiáng)、容易培養(yǎng)，生長(zhǎng)繁殖速度快，在人類生活，尤其是對(duì)池塘河流、湖泊等水 體污染凈化方面起到重要作用，并在水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境處理方面得到大規(guī)模推廣和應(yīng)用。
[0003] 光合菌傳統(tǒng)應(yīng)用模式主要是菌液形式，這種形式可以保持菌體鮮活進(jìn)入池塘，并 快速生長(zhǎng)繁殖；但缺點(diǎn)是菌體容易衰亡，且保藏、運(yùn)輸費(fèi)用高。若采用粉劑形式則可克服這 些問題。
[0004] 光合菌粉劑一般采用冷凍干燥法制備。而冷凍干燥中時(shí)間、溫度等工藝條件，以及 保護(hù)劑的選擇都是重要的控制因素。尤其是保護(hù)劑使用不當(dāng)，則光合菌細(xì)胞損失較大，造成 細(xì)胞回收獲較低的問題。目前，凍干工藝中經(jīng)常使用的保護(hù)劑有麥芽糊精、脫脂奶粉、甘油、 二甲亞砜、海藻糖等。其中麥芽糊精最常用且廉價(jià)，但用在光合菌上菌體損失較大；其它幾 種保護(hù)劑價(jià)格都較高，不利于大規(guī)模工業(yè)化操作。現(xiàn)有技術(shù)中為了解決保護(hù)劑各自的缺陷， 常規(guī)的思路就是用多種保護(hù)劑復(fù)配使用，綜合不同保護(hù)劑的特性和優(yōu)點(diǎn)。但是到目前為止， 本領(lǐng)域技術(shù)人員仍未找到特別理想的保護(hù)劑和光合菌粉劑制備工藝。光合菌粉劑的活性含 量比較低，加工效率不高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種經(jīng)濟(jì)、高效的光合菌粉劑制備方法。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：一種光合菌粉劑的制備方法， 步驟包括：
[0007] a、自行培養(yǎng)或購(gòu)買光合菌菌液備用；
[0008] b、用蔗糖和純凈水配置濃度為22-27%的蔗糖溶液備用；
[0009] c、取光合菌菌液，離心收集得濃縮菌液，并稱重；
[0010] d、將濃縮菌液與蔗糖溶液按重量比1:1的比例混合均勻，裝入塑料包裝袋，然后 在常壓下，-16°C~-25°C，冷凍2-4h，然后-65°C~_75°C冷凍10_15h ;再置于真空冷凍干 燥機(jī)內(nèi)進(jìn)行真空冷凍干燥，干燥時(shí)間20-26h，溫度-50°C以下，真空度200Pa以上；
[0011] e、粉碎物料即得到光合菌菌粉。
[0012] 優(yōu)選的，所述的蔗糖溶液濃度為25 %。
[0013] 優(yōu)選的，所述的步驟d中，真空冷凍干燥之前，常壓下，-20°C，冷凍3h，然后-70°C 冷凍12h。
[0014] 優(yōu)選的，所述的步驟d中，真空冷凍干燥條件為：-50°C，真空度250Pa，冷凍干燥時(shí) 間 24h。
[0015] 本發(fā)明的工藝操作簡(jiǎn)單，工藝銜接流暢，便于操作、管理。原料成本、設(shè)備成本、管 理成本都非常低。并且所制備的光合菌粉劑活性高、易復(fù)活。所制備的粉劑活菌數(shù)可達(dá) 5. 5X 10ncfu/g ;光合菌粉劑按照1%。接種量進(jìn)行接種，培養(yǎng)3d后OD6q?？蛇_(dá)I. 765,4d達(dá) 2. 101，遠(yuǎn)超過市場(chǎng)光合菌成品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求。而采用復(fù)配保護(hù)劑的產(chǎn)品和市售產(chǎn)品的活菌 數(shù)和復(fù)活性能都遠(yuǎn)低于本發(fā)明所制備的產(chǎn)品，很多市售產(chǎn)品甚至存在沒有活菌的問題。因 此，可以說本發(fā)明的制備方法是經(jīng)濟(jì)、高效率的。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 下面結(jié)合實(shí)施例介紹本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例和技術(shù)效果，但本發(fā)明的技術(shù)方案和構(gòu) 思不僅限于下述優(yōu)選實(shí)施例。
[0017] 實(shí)施例一
[0018] (1)自行培養(yǎng)光合菌菌液，菌種為市售的沼澤紅假單胞菌；具體操作方法為：
[0019] 1).培養(yǎng)基配方：NaAc lg/L、NH4Cl lg/L、NaHCO3 2g/L、KH2PO4 0· 5g/L、NaCl Ig/ UMgCl2 0· 2g/L、玉米漿 2g/L。其中，除 NH4Cl 和似!10)3外的原料 121°C，滅菌 IOmin ;NH4C1 和NaHCO3配制成10倍母液，真空抽濾滅菌，再以I :10添加到其余組分中制成無菌全價(jià)光 合細(xì)菌培養(yǎng)基，并分裝到5L三角瓶中；
[0020] 2).向光合菌培養(yǎng)基中按照5%接種量接種光合菌菌種；
[0021] 3).用塑料薄膜密封，置于白熾燈照射下30-37Γ培養(yǎng)2-3d即得到光合菌培養(yǎng)液， 收集光合菌菌液30L待用。
[0022] (2)取光合菌菌液，3500rpm離心10min收集濃縮菌液，并分組稱重；同時(shí)保留一組 培養(yǎng)液作為光合菌水劑樣品；
[0023] (3)配制不同的保護(hù)劑溶液：①麥芽糊精30%水溶；②蔗糖25%水溶液；③脫脂 奶粉25%水溶液；④脫脂奶粉20% +麥芽糊精10%水溶液；⑤脫脂奶粉20% +蔗糖10% 水溶液；⑥麥芽糊精20% +蔗糖10 %水溶液；
[0024] (4)菌粉制備：將濃縮菌液與上述6個(gè)配方溶液按質(zhì)量比1:1的比例混合均勻后， 分別裝入塑料包裝袋；先在常壓下，_20°C，冷凍3h，然后-70°C冷凍12h ;然后置于真空冷凍 干燥機(jī)內(nèi)，進(jìn)行真空冷凍干燥24h，冷凍溫度-50°C，真空度250Pa ;
[0025] (5)粉碎物料即得到光合菌菌粉。
[0026] 光合菌粉劑和水劑活菌計(jì)數(shù)：
[0027] 取Ig粉劑加到100毫升自來水中溶解，取1毫升進(jìn)行試管稀釋，最后取1毫升添 加到下層培養(yǎng)基中，制備雙層平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)梯度選擇10 6、10 7、10 8,每個(gè)梯度兩個(gè)重 復(fù)。培養(yǎng)后完成菌落計(jì)數(shù)。
[0028] 取留存的光合菌水劑按照平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)梯度選擇10 8、10 9、10 '每 個(gè)梯度兩個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)后完成菌落計(jì)數(shù)。結(jié)果見表1所示：
[0029] 表1活菌計(jì)數(shù)結(jié)果
[0030]

[0031] 可見，本發(fā)明的方法制備的光合菌粉劑活菌數(shù)較菌液沒有明顯差別，保持了較高 的活菌數(shù)濃度。
[0032] 光合菌菌粉復(fù)活實(shí)驗(yàn)：
[0033] 將光合菌菌粉按照一定濃度接種到液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，觀察其生長(zhǎng)復(fù)活情 況。濃度比例設(shè)置為1.5%。、1%。、0. 5%。、0. 2%。，每個(gè)梯度兩個(gè)重復(fù)。所用液體培養(yǎng)基組成 為：NaAc lg/L、NH4Cl lg/L、NaHC03 2g/L、KH2P04 0 . 5g/L、NaCl lg/L、MgCl2 0.2g/L、玉米漿 2g/L。各組樣品的OD6。。值測(cè)定結(jié)果見表2所示：
[0034] 表2 OD6。。值測(cè)定結(jié)果

[0037] 從接種后培養(yǎng)效果來看，六種方法制備的光合菌菌粉在0. 2%。-I. 5%。的接種范圍 內(nèi)都可以生長(zhǎng)。其中生長(zhǎng)情況最好的是保護(hù)劑為25%蔗糖溶液的樣品，其最低0. 2%。接種 量時(shí)OD平均值都能達(dá)到1. 847 ;其次是脫脂奶粉，最差的是麥芽糊精。因此為考慮經(jīng)濟(jì)性， 建議今后生產(chǎn)光合菌菌粉采用蔗糖25%，制備好的菌粉接種量定為0. 2%。。但單純從性能 上說，保護(hù)劑為25%蔗糖溶液的樣品，1%。接種量時(shí)，OD值能快速穩(wěn)定地達(dá)到2以上，具有最 佳的復(fù)活性能。并且試驗(yàn)證明該復(fù)活性能并不隨接種量的增加成正比增加，恰恰是在接種 量1%。時(shí)達(dá)到最佳效果。
[0038] 實(shí)施例二
[0039] (1)利用菌種培養(yǎng)光合菌菌液30升，菌種為市售的深紅紅螺菌，培養(yǎng)方法同實(shí)施 例一；本發(fā)明對(duì)光合菌菌液配置方法沒有依賴性，不同培養(yǎng)方法培養(yǎng)的光合菌菌液制備粉 劑都呈現(xiàn)類似的特性；如果有適合配套條件，也可以直接購(gòu)買菌液使用；
[0040] (2)取光合菌菌液，3000rpm離心12min收集濃縮菌液，并分組稱重；
[0041] (3)配制保護(hù)劑溶液：濃度為25 %的蔗糖水溶液備用；
[0042] (4)菌粉制備：將各組濃縮菌液與25%的蔗糖水溶液按質(zhì)量比1:1的比例混合均 勻后，分別裝入塑料包裝袋；先在常壓下，-20°C，冷凍3h，然后-70°C冷凍12h ;然后置于真 空冷凍干燥機(jī)內(nèi)，進(jìn)行真空冷凍干燥24h，冷凍溫度-65°C，真空度200Pa ;
[0043] (5)粉碎物料即得到光合菌菌粉。
[0044] 取市售樣品五組，市售產(chǎn)品來源如下：
[0045]

[0046] 隨機(jī)取本發(fā)明制備的樣品三組，標(biāo)記為樣品1、2、3,密封、遮陰、常溫保藏3個(gè)月； 然后與5組市售樣品，按實(shí)施例一介紹的方法進(jìn)行活菌數(shù)檢測(cè)和復(fù)活性試驗(yàn)，結(jié)果如表3所 示：
[0047] 表3本發(fā)明產(chǎn)品與市售產(chǎn)品的對(duì)比試驗(yàn)數(shù)據(jù)表
[0049] 注："無"代表無法檢測(cè)到活菌。
[0050] 可見，本發(fā)明的產(chǎn)品在產(chǎn)品活菌數(shù)、復(fù)活性能等方面明顯優(yōu)于市售產(chǎn)品的整體狀 況。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種光合菌粉劑的制備方法，步驟包括： a、 取光合菌菌液備用； b、 用蔗糖和純凈水配置濃度為22-27%的蔗糖溶液備用； c、 取光合菌菌液，離心收集得濃縮菌液，并稱重； d、 將濃縮菌液與蔗糖溶液按重量比1:1的比例混合均勻，裝入塑料包裝袋，然后在常 壓下，-16°C~_25°C，冷凍2-4h，然后-65°C~-75°C冷凍10_15h ;再置于真空冷凍干燥機(jī) 內(nèi)進(jìn)行真空冷凍干燥，干燥時(shí)間20-26h，溫度-50°C以下，真空度200Pa以上； e、 粉碎物料即得到光合菌菌粉。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種光合菌粉劑的制備方法，其特征在于：所述的蔗糖溶液 濃度為25%。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種光合菌粉劑的制備方法，其特征在于：所述的步驟d中， 真空冷凍干燥之前，常壓下，_20°C，冷凍3h，然后-70°C冷凍12h。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種光合菌粉劑的制備方法，其特征在于：所述的步驟d中， 真空冷凍干燥條件為：-50°C，真空度250Pa，冷凍干燥時(shí)間24h。5. 用于上述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述制備方法的保護(hù)劑，由蔗糖和純凈水配置為濃度 22-27%的蔗糖溶液。6. 權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)制備方法所獲得的光合菌粉劑的復(fù)活方法，將光合菌菌粉 按照1%。的濃度接到液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基的組成為：NaAc lg/L、NH4Cl Ig/ UNaHCO3 2g/L、KH2PO4 0.5g/L、NaCl lg/L、MgCl2 0.2g/L、玉米漿 2g/L。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種微生物制劑，目的是提供一種經(jīng)濟(jì)、高效的光合菌粉劑制備方法。制備方法的步驟包括：a、培養(yǎng)光合菌菌液備用；b、用蔗糖和純凈水配置濃度為22-27％的蔗糖溶液備用；取光合菌菌液，離心收集得濃縮菌液，并稱重；c、將濃縮菌液與蔗糖溶液按重量比1:1的比例混合均勻，裝入塑料包裝袋，在常壓下，-16℃～-25℃，冷凍2-4h，然后-65℃～-75℃冷凍10-15h；再真空冷凍干燥，冷凍干燥時(shí)間20-26h，溫度-50℃以下，真空度200Pa以上；d、粉碎物料即得到光合菌菌粉。本發(fā)明的工藝操作簡(jiǎn)單，工藝間接流暢，便于操作、管理。原料成本、設(shè)備成本、管理成本都非常低。并且所制備的光合菌粉劑活性高、易復(fù)活。
【IPC分類】C12N1/20
【公開號(hào)】CN105018374
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510396949
【發(fā)明人】蘇艷秋, 羅國(guó)強(qiáng), 李永凱, 符燕華, 劉梅, 李程
【申請(qǐng)人】通威股份有限公司
【公開日】2015年11月4日
【申請(qǐng)日】2015年7月8日